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蝰蛇是世界上的主要毒蛇之一，蝰蛇(缅甸亚种)属于蝰科蝰亚科，主要分布于东南亚的十几个国家和地区，其毒性强。蝰蛇毒中含有丰富的血液毒素，至今已从其中分离出多种凝血毒素，如凝血因子Ⅹ激活剂(RVV-Ⅹ)、凝血因子Ⅴ激活剂(RVV-Ⅴ)，而对其抗凝血毒素研究未见报道。本实验从蝰蛇(缅甸亚种)毒中分离出一种具有纤维蛋白溶解活性的蛋白组分FⅡaa，并进一步探讨了FⅡaa的生物活性特点。
方法和结果
1、蛇毒纤溶酶FⅡaa的分离纯化
蛇毒纤溶酶FⅡaa经过三步分离程序得到。粗毒经过CM-SephadexC-50阳离子交换层析得到11个蛋白峰，用纤维蛋白平板法检测其活性，其中第2(FⅡ)和6峰(FⅥ)具有较高的纤溶活性。FⅡ进一步经SuperdexTM75凝胶层析得到三个蛋白峰，其中主峰即FⅡa具有纤溶活性，将其再经过DEAE-SephadexA-50阴离子交换层析得到三个蛋白峰，其中第1峰(FⅡaa)具有较强的纤溶活性。
FⅡaa经SDS-PAGE电泳显示为单一条带，分子量为69000。
2、温度和酸碱度对FⅡaa的影响
2.1FⅡaa作用最适温度和最适pH值的测定
以Azocasein为反应底物观察FⅡaa在不同的温度和pH值条件下蛋白水解活性，在30-50℃范围内，活性随着温度的升高而升高，50℃时FⅡaa的活性达到最大值，温度超过50℃后，活性迅速下降。不同pH值条件下水解Azocasein活性不一。实验结果显示，pH在8.0到10.0这个范围内，FⅡaa的活性水平较高pH10.0时达到最大值。在极端的pH条件下(3.0-5.0，12.0)FⅡaa的活性被抑制。
2.2热稳定性和pH稳定性
FⅡaa在经过30-60℃的温度处理15分钟后，相对活性仍然维持在95％以上，当温度超过60℃时，FⅡaa相对活性迅速下降，70℃时，FⅡaa相对活性为53％，温度达到80℃时，FⅡaa相对活性为5％，说明经过高温处理后FⅡaa已经完全失活。
FⅡaa在不同的pH缓冲液处理后，相对活性最高的是pH9.0组，达到107％，从pH8.0-11.0，相对活性维持在100％以上的水平。此结果与FⅡaa的最适pH结果相似，这两个实验提示FⅡaa在碱性的环境下活性较高且稳定性好。3、FⅡaa的纤维蛋白(原)溶解作用
3.1FⅡaa降解纤维蛋白原(Fibrinogen，Fg)的作用
纤维蛋白原和不同浓度的FⅡaa37℃保温后，不同时间点取样做SDS-PAGE，以纤溶酶作阳性对照。结果表明FⅡaa对纤维蛋白原的Aα链、Bβ链和γ链均有水解作用，对Aα链最敏感，Bβ链其次，γ链则需要较高浓度且作用时间较长才能水解。Aα链、Bβ链、γ链水解后产生不同分子量的片段，随着时间的推移，这些片段也有水解。
3.2FⅡaa降解纤维蛋白(Fb)的作用
采用纤维蛋白平板法测定FⅡaa纤维蛋白溶解活性。不同浓度的FⅡaa20μl加到纤维蛋白平板表面，以尿激酶和生理盐水分别作阳性和阴性对照。结果显示FⅡaa可溶解纤维蛋白且有量效关系，每毫克FⅡaa相当于54.25U的尿激酶纤溶活力。FⅡaa(1mg/ml)在加热纤维蛋白平板中有溶解纤维蛋白的透明圈，而尿激酶(50U/ml)没有。提示FⅡaa能够直接溶解纤维蛋白。
纤维蛋白和FⅡaa37℃保温后，不同时间点取样作SDS-PAGE分析，以纤溶酶作阳性对照。结果显示，FⅡaa对纤维蛋白的α链、β链和γ-γ二聚体均有水解作用，对α链最敏感，β链其次，而对γ-γ二聚体的水解作用较弱。其产生的水解片段和纤溶酶不同。
4、蛋白酶抑制剂及金属螯合剂对FⅡaa蛋白酶活性的影响
FⅡaa与不同的蛋白酶抑制剂PMSF、DTT、抑肽酶及金属螯合剂EDTA37℃温浴30min后测定其水解Azocasein的相对活性。结果显示，金属螯合剂EDTA和巯基还原剂DTT可以抑制FⅡaa的蛋白水解活性。而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF及其它蛋白酶抑制剂抑肽酶对FⅡaa的蛋白水解活性没有抑制作用。
5、出血活性测定
蛇毒纤溶酶FⅡaa(0.025、0.05、0.075、0.1、0.125mg/ml)0.1ml皮下注射，6小时后取皮并测量皮内侧面出血点直径分别为7.7±1.0、9.9±1.4、10.5±1.8、12.7±1.4、13.5±1.3mm。最小出血剂量(MHD)为6μg。粗毒(0.1mg/ml)引起的出血点直径为10.3±2.4mm，相当于FⅡaa0.065mg/ml。
结论
1.蝰蛇(缅甸亚种)粗毒经过CM-Sephadex-C-50阳离子交换层析、SuperdexTM75凝胶层析、DEAE-SephadexA-50阴离子交换层析得到电泳纯的蛇毒纤溶酶FⅡaa。
2.FⅡaa为大分子量的蛋白酶，其最适作用温度约为50℃，最适pH值约为10.0。
3.FⅡaa为α-纤溶酶，既可降解纤维蛋白原，又可降解纤维蛋白，其作用方式直接的。
4.FⅡaa为金属蛋白酶。
5.FⅡaa具有较强的出血活性。