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水稻类病变突变体是由于自身遗传物质的改变会在无逆境胁迫和病原菌侵染情况下自发出现坏死斑表型。大多数突变体会表现出抗病基因的上调表达,植株获得系统获得性抗性,增强对病原菌的抗性,因此类病变突变体被认为是研究细胞死亡和防御应答的重要材料。在本实验室前期研究中,从T-DNA插入突变群体中鉴定到一个类病变突变体Cdr4(cell death and resistance 4)。Cdr4突变体叶片在抽穗期开始出现类病斑,通过遮光实验发现Cdr4突变体的类病变表型受自然光诱导;Cdr4突变体叶片中大量活性氧的积累是产生类病斑的重要原因;遗传分析表明,Cdr4表型由一个显性单基因控制,通过Tail-PCR实验确定插入位点在在水稻2号染色体上1.6 Mb处。在此基础上通过定量实验分析插入位点下游10 kb内基因表达量变化来确定候选基因,又利用转基因技术验证候选基因的功能;确定候选基因CDR4后通过酵母双杂筛选出互作蛋白,并通过分析互作蛋白的功能来研究CDR4的功能;利用RNA-Seq及生物信息学分析,筛选CDR4调控的抗病相关基因,通过定量验证相关基因的表达量变化,最后结合互作蛋白功能研究来阐明CDR4调控水稻抗病反应的分子机理。首先通过RT-qPCR分析插入位点附近基因表达量,发现Os02g0131800基因的表达量在Cdr4突变体中上调19倍,并通过RT-PCR验证这一结果。利用转基因技术,在Cdr4突变体中敲除Os02g0131800基因,共获得24株转基因植株,其中有3株纯合突变体。在成熟期,Cdr4突变体叶片已充满类病斑,但这3株纯合突变体无类病斑的产生,确定CDR4的候选基因就是Os02g0131800基因。然后构建了酵母双杂的cDNA文库,并将CDR4基因构建到诱饵载体上(无自激活现象),通过酵母双杂实验筛选到20个与CDR4有相互作用的蛋白,测序发现编码这20个蛋白的基因分布在水稻除7、9、12外的其他9条染色体中,这些蛋白的功能各不相同,推测CDR4可能参在水稻多个生命活动过程发挥重要作用。其中OsSPL1会参与调控植株抗病反应,可能与CDR4介导的水稻抗病相关,实验有对OsSPL1和CDR4做了一对一酵母双杂验证,结果表明CDR4和OsSPL1确实存在相互作用,说明CDR4通过与OsSPL1相互作用,可能改变OsSPL1的酶活性,从而影响植株内S1P的含量,进而提高了植株的抗病性。最后通过RNA-Seq技术和生物信息学分析,发现Cdr4与野生型基因表达量具有显著差异,在Cdr4突变体中变现为表达上调的有187个,在Cdr4突变体中变现为表达下调的有134个,总共筛选出321个具有显著表达量差异的基因。通过GO分析发现差异表达基因富集在几丁质分解代谢和几丁质酶活性中;KEGG Pathway分析发先差异表达基因富集在植物-病原体相互作用通路中,这表明差异表达基因的功能大多与植物防御反应相关,通过定量分析发现在Cdr4中抗病相关基因表达量存在上调趋势,接菌实验表明Cdr4对白叶枯病菌的抗病性显著增强。综上所述,CDR4基因的表达上调是导致Cdr4突变体产生类病变的原因,CDR4通过与OsSPL1互作,可能增加了植株内S1P的含量,使得抗病相关基因表达量上升,激活植株防御反应,从而提高了植株的抗病性。