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天花粉蛋白(Trichosanthin)是从中药植物栝楼块根中提取的一种I型核糖体失活蛋白,主要有两大天然活性:1)N-糖苷酶活性,使28S RNA上特定位点的N-C糖苷键断裂,从而抑制蛋白质的翻译;2)拓扑异构酶活性,使DNA分子拓扑学构象发生改变,催化其断裂为无活性产物。近年来天花粉蛋白对肿瘤细胞生长的抑制效应引起人们的关注。研究表明,Trichosanthin的跨膜途径是由低密度脂蛋白相关受体蛋白1(LRP1)介导,所以这种穿膜机制主要局限于绒毛膜癌、黑色素瘤细胞(膜表面LRP1较多)等少数几种肿瘤细胞,而大多数肿瘤细胞由于缺乏LRP1,导致Trichosanthin的穿越肿瘤细胞膜效率较低,由此限制了 Trichosanthin在抗肿瘤方面的应用。本课题期望通过一种高效运输载体将Trichosanthin有效运输到多种肿瘤细胞内发挥其抗肿瘤活性,以增强其肿瘤细胞的杀伤效应。细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides,CPPs)具有介导生物活性分子高效跨膜的能力。人免疫缺陷病毒(HIV-1)来源的TAT是最早发现的一种经典的穿膜肽,本课题首先通过将TAT分别融合在Trichosanthin的C端或N端获得重组蛋白Trichosanthin-TAT和TAT-Trichosanthin以观察TAT的引入对Trichosanthin内在生物学活性的影响。实验结果表明,TAT融合在Trichosanthin的N端会影响其活性,而Trichosanthin的C端融合TAT对其生物学活性基本没有影响;MTT实验表明:没有融合TAT的Trichosanthin对HeLa 细胞的 IC50值为 9.25 μM,Trichosanthin-TAT 的 IC50值为 6.87 μM,表明 Trichosanthin融合了 TAT后抗肿瘤能力比天然Tirchosanthin有一定的提升。为了得到一种具有更高抗肿瘤能力的Trichosanthin重组蛋白,本课题对一种来源于HBEGF(human heparin binding-EGF-like growth factor)的人源性肝素结构域 HBP 进行了穿膜活性研究,鉴定出其具有高效的穿膜能力,随后将其融合到大分子药物蛋白Tirchosanthin的C端,获得重组蛋白Trichosanthin-HBP。实验结果表明,C端融合高效穿膜肽HBP的Trichosanthin具有明显的细胞质定位,MTT实验表明Trichosanthin-HBP具有显著的肿瘤细胞杀伤效应,对HeLa细胞的IC50为0.16μM,与没有融合HBP的Trichosanthin相比提升了近60倍,表明穿膜肽HBP可以有效的携载Trichosanthin蛋白进入细胞并发挥对肿瘤细胞生长的抑制效应。Western Blot实验表明,Trichosanthin-HBP是通过强化线粒体途径与死亡受体途径来诱导更多的肿瘤细胞发生凋亡。通过内吞进入细胞的大分子药物,往往会滞留于内吞体中,为了进一步提高药物从内吞体中有效释放的效率,本课题探索研究了一种基于钙调蛋白的内吞体逃逸策略:钙调蛋白(Calmodulin,CaM)是一种在人和鼠体内高表达的调控蛋白,能够促进内吞体中蛋白药物分子的释放。期望这种基于CaM的新型给药策略有助于药物有效进行内吞体逃逸,使更多的药物分子进入细胞质发挥药效。