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长期以来,吗啡都作为一种镇痛特效药应用于临床,但吗啡对调节中枢神经系统神经元死亡或存活的作用尚不清楚。本实验以胞内淀粉样蛋白造成的细胞毒性作为AD的模型,研究吗啡对中枢神经系统细胞的作用。结果如下:
(1)通过显微注射的方法,向人胚和大鼠乳鼠的原代神经元中微注射Aβ1-42,Aβ1-42处理细胞24小时能够引起50％的细胞死亡。胞外孵育1μM的吗啡,内吗啡-1(EM-1)和内吗啡-2(EM-2)能够减少约50%的细胞死亡。
(2)对显微注射Aβ1-42的大鼠海马神经元进行电生理记录,结果表明Aβ1-42减小了全细胞的k+电流强度和A型k+电流。吗啡阻止了Aβ1-42引起的全细胞K+电流和A型K+电流的减小。
(3)将包裹有胞内Aβ1-42的腺病毒注射到大鼠的CA1区,通过水迷宫实验验证大鼠的空间记忆。胞内Aβ1-42增加了大鼠寻找平台的时间和游泳路程。吗啡反转了Aβ1-42引起大鼠空间学习记忆的障碍。
(4)阿片受体的广谱拮抗剂纳洛酮(1μM)和MOR的拮抗剂β-funaltrexamine(β-FNA,1μM)能够显著抑制吗啡对神经元的保护作用,这说明MOR参与了吗啡的保护作用。
(5)雌激素受体(Ers)的拮抗剂tamoxifen(Tax,10μM)能够显著减小吗啡的保护作用。这表明Ers可能参与了吗啡的保护作用。
(6)通过双荧光素酶报告基因实验检测吗啡是否能够激活雌激素受体,结果显示,吗啡(1μM)和雌激素(10nM)有着相同的激活雌激素反应元件(estrogen rgsponse elements,ERE)下游的荧光素酶表达的效果。这说明吗啡能够激活雌激素受体,使其发挥转录功能。
(7)通过免疫印迹测定吗啡处理的神经元中雌激素受体的表达量,结果显示,吗啡处理后雌激素受体的表达量上升。测定吗啡处理神经元培养基中雌二醇的含量,结果显示和对照组相比,吗啡处理组雌二醇βE2和代谢产物雌酮的含量明显升高,这说明吗啡具有促进雌激素分泌的功能。
(8)将细胞色素芳香酶P450的siRNA微注射到吗啡处理的神经元中,吗啡对细胞的保护作用下降,荧光定量PCR的结果表明吗啡处理的神经元细胞中细胞色素芳香酶P450的表达上升。以上结果表明,雌激素的水平对于吗啡对细胞的保护作用有影响。
(9)吗啡处理能引起海马神经元中Hsp70水平显著增加。使用雌激素受体的拮抗剂tamoxifen能够抑制吗啡引起的Hsp70表达水平的上升。以上结果表明,吗啡处理引起的Hsp70表达水平的上升是由吗啡诱导的雌激素系统的激活引起的。
(10)抑制Hsp70的表达能够完全阻断吗啡对细胞的保护作用。这表明雌激素诱导的Hsp70表达水平的上升介导吗啡对细胞的保护作用。
(11)测定蛋白酶体活力的实验结果表明,胞内Aβ1-42可以抑制蛋白酶体活性,从而抑制胞内蛋白的降解,而Hsp70能够逆转胞内Aβ1-42引起的蛋白酶体活性的抑制。
本论文发现吗啡在大鼠海马和人胚全脑细胞中对抗胞内Aβ1-42引起的神经元损伤,这种作用是通过激活吗啡受体并激活雌激素受体介导的。另外,本文首次发现吗啡具有促进神经元分泌雌激素的作用,雌激素的分泌和雌激素受体的激活促进Hsp70的表达,从而反转胞内Aβ1-42对蛋白酶体活性的抑制,从而保护神经元细胞。本论文也证明了吗啡在在体动物损伤模型中对学习记忆有保护作用。这为吗啡的临床应用和老年痴呆症的治疗提供了新的视角。