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1995年Sakaguchi等人首次报道在正常小鼠的外周血CD4+T细胞中约有5%～10%的细胞持续高表达CD25分子(IL-2受体α链),同时这一亚群细胞是CD45RB分子低表达的,称之为CD4~+CD25~+调节性T细胞(CD4~+CD25~+ regulatory T cell,简称CD4~+CD25~+Treg)。CD4~+CD25~+Treg能通过“主动”方式抑制免疫系统对自身和外来抗原的应答,在维持自身免疫耐受中发挥重要作用。许多肿瘤相关抗原是正常的自体成分,而不是突变基因的异常产物,表明肿瘤免疫在一定程度上是一种自身免疫,因此CD4~+CD25~+ Treg具有抑制肿瘤免疫的作用。白血病是一类起源于造血干细胞的克隆性恶性肿瘤,近年来白血病的免疫治疗逐渐成为白血病治疗中的热点,但是肿瘤抗原特异的免疫治疗效果目前并不十分令人满意,可能与肿瘤细胞能通过某种机制逃避免疫系统的攻击有关。现已证实CD4~+CD25~+Treg细胞可以抑制肿瘤特异性免疫反应,对免疫治疗起负调控作用,是肿瘤免疫抑制的又一机制。为了探讨恶性血液病发展中CD4~+CD25~+Treg的负性调节作用。本课题拟研究以下内容:①检测急性白血病患者外周血CD4~+CD25~+Treg含量。②通过小鼠体外实验观察肿瘤是否可以诱导CD4~+CD25~+Treg比例上调。第一部分:恶性血液病患者外周血CD4~+CD25~+调节性T细胞的检测目的:检测急性白血病患者外周血CD4~+CD25~+Treg亚群的变化,探讨其在恶性血液病发病中的意义。方法:选取山西医科大学第二医院血液科2007年9月~2008年5月急性白血病患者(AL)32例,均为初发化疗前的住院患者,男性20例,女性12例,患者平均年龄53.6岁。全部急性白血病患者均经临床、骨髓细胞学、免疫分型检查确诊。对照组为本院体检健康者16例,男10例,女6例,平均年龄48.2岁。采集外周血,用流式细胞仪检测CD4~+CD25~+Treg细胞含量。同时应用ELISA法检测患者和健康对照血清TGF-β和IL-10水平,并分析了急性白血病患者血清中IL-10和TGF-β水平与CD4~+CD25~+Treg的相关性。淋巴细胞的百分比以mean±SD表示,组间均数比较采用独立样本t检验。结果:急性白血病患者外周血的CD4~+CD25~+Treg细胞占CD4+T细胞的比例高于正常对照(3.96±1.86) % vs (2.08±1.63)% (P<0.01),与文献报道一致。急性白血病患者外周血CD4~+CD25~+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的比例明显高于正常对照(3.22±1.01)% vs(0.83±0.72)% (P<0.01),急性白血病患者外周血CD4+ Foxp3+ T细胞比例显著高于正常对照(14.9±2.92)% vs (5.68±1.21)% (P<0.001)。ELISA方法检测急性白血病患者血清TGF-β1和IL-10分别为26.9±5.2ng/ml和74.6±8.7 pg/ml。外周血CD4~+CD25~+Treg细胞含量与血清TGF-β1(r=0.508,P<0.05)、IL-10 (r=0.556, P<0.05)水平呈正相关。结论:急性白血病患者外周血的CD4~+CD25~+ Treg细胞比例显著高于正常对照,提示CD4~+CD25~+ Treg比例增高导致白血病患者抗肿瘤免疫功能低下,使肿瘤易于生长和转移。②急性白血病患者外周血CD4~+CD25~+Treg细胞含量与血清IL-10和TGF-β表达水平均呈正相关,说明IL-10和TGF-β都在CD4~+CD25~+Treg细胞抑制效应中发挥重要作用。这些研究将为以CD4~+CD25~+Treg为靶点的免疫调控策略提供有益的启示。第二部分:肿瘤细胞在小鼠体外对CD4~+CD25~+调节性T细胞的影响目的:通过小鼠体外实验观察肿瘤细胞分泌的可溶性物质是否可诱导CD4~+CD25~+ Treg的分化增殖,本研究旨在对恶性血液病患者CD4~+CD25~+Treg升高的机制进行初步探索。方法:用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液培养来源于C57BL/6小鼠的淋巴瘤细胞株EL-4和红白血病瘤细胞系FBL3, 5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养,制备肿瘤细胞培养上清液。选6-8周龄雄性C57BL/6小鼠常规颈椎脱臼处死,无菌取出脾脏,用100目不绣钢目制备脾细胞悬液,调整活细胞浓度为1×10~7/ml。取6孔板分四组:第一组为空白对照:0.5 ml小鼠脾脏淋巴细胞+1ml1640培养液。第二组:0.5 ml小鼠脾脏淋巴细胞+1ml瘤细胞培养上清液。第三组:0.5ml小鼠脾脏淋巴细胞+CD3单抗(终浓度为2μg/ml)+1ml 1640培养液。第四组:0.5 ml小鼠脾脏淋巴细胞+CD3单抗(终浓度为2μg/ml)+1ml瘤细胞培养上清液。培养72小时后用流式细胞仪检测各组中CD4~+CD25~+ Treg含量;RT-PCR检测CD4+CD25 +Treg细胞特异性标记Foxp3 mRNA的表达,试验重复3次。结果:结果表明EL-4细胞培养上清液诱导组CD4~+CD25~+Treg占淋巴细胞比例明显高于空白对照组(11.4±0.51%,6.3±0.34%,P<0.05);CD3单抗和EL-4培养上清液共同诱导组CD4~+CD25~+Treg占淋巴细胞比例与CD3单抗对照组相比有统计学差异(12.8±0.59%,8.1±0.41%,P<0.05);同样FBL3上清液诱导组CD4~+CD25~+Treg占淋巴细胞比例明显高于空白对照组(11.8±0.93%,7.03±0.75%,P<0.05);CD3单抗和FBL3培养上清液共同诱导组CD4~+CD25~+Treg比例明显高于CD3单抗对照组(13.1±0.56%,9.19±0.38%,P<0.05)。RT-PCR检测发现其特异性标记分子Foxp3 mRNA的表达在加入瘤细胞(EL-4和FBL3)培养上清液诱导后也明显增加。表明这些肿瘤细胞上清液中可能存在某种免疫调节因子促使小鼠脾脏CD4~+CD25~+Treg细胞比例上调。结论:肿瘤细胞培养上清液能促进小鼠淋巴细胞CD4~+CD25~+Treg比例升高,同时其特异性标记分子Foxp3 mRNA的表达明显增加。本研究通过体外试验证明了肿瘤微环境诱导了CD4~+CD25~+Treg细胞的增殖,说明是肿瘤的发生促进了CD4~+CD25~+Treg增高。综上所述本研究结果表明①急性白血病患者CD4~+CD25~+Treg细胞比例增高可能使患者免疫功能受损。②肿瘤细胞分泌的可溶性物质可诱导CD4~+CD25~+Treg细胞的增殖,说明肿瘤的发生可促进CD4~+CD25~+Treg增高。这些发现不仅可以更好的解释恶性血液病患者免疫功能低下、患病宿主预后较差的事实,而且提示CD4~+CD25~+Treg细胞可以成为治疗肿瘤的一个新的靶点。本研究初步揭示了恶性血液病患者免疫功能受损的机制,为临床恶性血液病的发病机制及有效的肿瘤免疫治疗等研究奠定了基础。