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为了改善人Cu,Zn-SOD的酶学性质,我们试图从酶分子的改造出发,借鉴EC-SOD独有的特性,在人Cu,Zn-SOD的C末端加入一肝素亲和肽,构建人Cu,Zn-SOD工程酶。根据Cu,Zn-SOD基因的碱基序列,我们设计并合成了两条寡合苷酸引物,利用PCR技术,从本室保留的菌种中成功的钓取Cu,Zn-SOD基因片段,大小为490 bp。经酶切后定向克隆于载体pPIC 9中,构建了高效表达重组质粒pPIC 9 Cu,Zn-SOD。此外,我们从随机组合肽库的肝素亲和筛选结果出发,设计了一肝素亲和肽序列。用化学法合成两条有15bp互补的寡核苷酸链,经退火、补平后得到了长66bp的肝素亲和肽基因。此基因片段编码的精氨酸7肽在随机组合肽库的肝素亲和筛选中表现最强的亲和能力。将此7肽基因融合到Cu,Zn-SOD基因的C末端,定向克隆于表达载体pPIC 9,电转化至毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导表达,获得了含有人Cu,Zn-SOD工程酶(HBSOD)基因的工程菌。由于毕赤酵母载体自身带有信号肽的特点,目标蛋白位于培养基的上清中,SDS-PAGE检测目标蛋白的表达量占可溶性蛋白的10%左右。人Cu,Zn-SOD工程酶经热变性、DEAE-Sepharose F.F.离子交换柱层析、SephacylS-100 H.R.分子筛柱层析后,得到的酶达到电泳纯。经分离纯化后得到的工程酶分子量为22kD左右,表明肝素亲和肽已融合到Cu,Zn-SOD的C末端。