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肿瘤细胞具有恶性无限增殖的特性。因此，相比正常分化的体细胞而言，肿瘤细胞对维持生物合成相关的能量与前体分子的需求急剧增加。为了适应肿瘤组织的快速生长，肿瘤细胞内的代谢途径往往发生了部分或整体的重编程。最近的文献提示，肿瘤细胞中代谢结构的重塑主要涉及了胞浆内和线粒体内多条关键代谢通路活性状态的改变，这些代谢通路的异常活化或抑制目前被广泛的认为是引发并维持肿瘤细胞无限增殖等恶性表型的分子基础。总体而言，肿瘤细胞中普遍发生的代谢重编程事件主要体现在：1、细胞内整体能量分子利用平衡的改变，如增强的葡萄糖和谷氨酰胺代谢；2、合成代谢途径的活化，如核酸和膜脂质的合成；3、整体氧化还原稳态的调整，如胞浆内NAD+/NADH比例的变化等。 在真核细胞中，丙酮酸（pyruvate）是衔接糖酵解（glycolysis）和三羧酸循环（tricarboxylic cycle，TCA cycle）的关键代谢中间产物，而线粒体介导的丙酮酸氧化过程也是真核细胞中碳水化合物、脂肪酸和氨基酸分解及合成等关键代谢途径的核心枢纽。因此，丙酮酸的代谢方式往往直接参与了真核细胞中不同生物化学稳态的调节。在人体细胞中，丙酮酸可经由葡萄糖的糖酵解过程产生。同时丙酮酸的分解代谢受到多个载体蛋白和酶复合物的调控，其主要包括了：线粒体丙酮酸载体（mitochondrial pyruvate carrier, MPC）和丙酮酸脱氢酶复合体（pyruvate dehydrogenase complex, PDHc）等。细胞内MPC和 PDH的表达水平变化或酶活性的改变可直接影响丙酮酸的代谢去向。尽管大量的研究表明肿瘤细胞相对倾向利用糖酵解途径获取能量。然而，最近的研究发现：线粒体作为真核细胞内总体代谢枢纽，其介导的生物大分子合成途径在维持肿瘤细胞快速增殖的过程中仍然起着不可替代的作用，其中包括主要依赖丙酮酸的生物合成途径。这些研究表明：维持线粒体合成代谢功能的分子机制对于恶性肿瘤细胞的快速增殖和侵袭转移过程具有重要作用。大量研究发现，除了异常活化的葡萄糖和丙酮酸代谢之外，肿瘤细胞中的谷氨酰胺代谢途径亦普遍表现出增强的生物学活性。谷氨酰胺是广泛存在于血浆和组织液中含量最为丰富的非必须氨基酸。做为细胞内的重要氮源，谷氨酰胺直接参与了嘧啶和嘌呤的生物合成。此外，谷氨酰胺还可以作为能量底物在线粒体中被转化为α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，αKG）进入TCA循环，以补偿细胞快速增殖所需要的额外的能量和合成代谢需求。尽管代谢结构的异常变化早已被大量的临床和实验室研究所证实。然而，有关葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺等关键代谢通路的活性在肿瘤细胞的形成、发展过程中所起的具体作用至今仍不完全清楚。 最近有多项研究提示，肿瘤细胞中MPC和PDH基因水平低表达或蛋白的低活性均与肿瘤的恶性表型紧密相关。并且，MPC和PDH在某些肿瘤组织中的表达水平可以作为评估肿瘤病人预后的独立指标。此外，在我们的前期研究中发现，当在前列腺癌细胞中敲除PDH的亚单位E1α（PDHA1 KO）或使用选择性抑制剂UK5099抑制 MPC活性的情况下，体外培养的前列腺癌细胞可表现出一系列增强的干细胞特征。由于肿瘤组织中干细胞因子的高表达往往和较差的分化结构与增强的恶性表型相关。由此我们推断，PDH或 MPC的功能障碍可能在前列腺癌的疾病进展中起着重要作用。因此，研究并澄清肿瘤细胞中异常的丙酮酸代谢途径，如 PDH和MPC活性或功能性抑制所引发的肿瘤细胞代谢结构重编程效应，可为今后靶向干预肿瘤细胞代谢的治疗策略提供重要的理论依据。 综上所述，我们在前期工作的基础上，现利用气象色谱时间飞行质谱（Gas Chromatography Time Flight Mass Spectrometry，GC-TOF-MS）技术分析并研究了LNCaP PDHA1 KO细胞与亲本细胞中代谢谱的差异。根据所获得的数据，我们进一步分析了前列腺癌细胞中 PDHE1α缺失所造成的代谢通路的改变。基于代谢组学得到的初步结果，我们进一步使用13C标记的葡萄糖和谷氨酰胺（13C6-Glucose和13C5，15N2-Glutamine）作为能量代谢底物，联合使用 GC-MS和核磁共振（Nuclear magnetic resonance，NMR）技术探讨了二者的的代谢去向。我们首次发现并着重研究了谷氨酰胺分解通路在 PDHE1α缺失的前列腺癌中的代谢调节作用及其作为潜在的列腺癌治疗靶点的可能性；除此之外，通过应用MPC特异性抑制剂UK5099，我们还建立了LNCaP和DU145细胞的MPC功能障碍模型。利用这些模型，我们深入研究了MPC功能障碍对前列腺癌细胞中代谢结构的影响。 以上研究内容从肿瘤的代谢特性作为切入点，深入探讨了线粒体丙酮酸代谢障碍所引发的代谢重编程效应。着重研究了谷氨酰胺分解通路活化补偿线粒体呼吸代谢的具体机制，并探讨了其在前列腺癌细胞恶性转化过程中的生物学效应。以上研究扩展了现阶段肿瘤研究领域中有关肿瘤细胞丙酮酸代谢障碍与谷氨酰胺代谢活化及其分子机制的相关认识，同时也为恶性肿瘤的临床诊治和相关药物开发提供了新的实验依据。 第一部分：前列腺癌细胞中丙酮酸脱氢酶缺陷对代谢表型影响的研究 研究方法： 1．以稳定敲除PDHE1α基因的LNCaP细胞系（LNCaP PDHA1 KO）为模型，使用GC-TOF-MS代谢组学分析LNCaP亲本细胞和PDHA1 KO细胞内的代谢结构差异；根据得到的差异代谢物进一步利用 MetaboAnalyst2.0（http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/）分析相关的代谢通路的改变。 2．以13C6-Glucose和13C5，15N2-Glutamine为代谢底物，利用GC-MS和NMR测定LNCaP亲本细胞LNCaP PDHA1 KO细胞中内源性小分子代谢产物的指纹图谱，并通过同位素示踪法追踪葡萄糖和谷氨酰胺的代谢去向。 研究结果： 1.通过GC-TOF-MS技术平台鉴定出LNCaP亲本细胞和LNCaP PDHA1 KO细胞之间存在丰度差异的已知代谢物共45个，两组之间具有明显改变的代谢通路15个，其中谷氨酰胺分解通路为两组细胞间活性状态具有明显差异的代谢通路之一。 2.使用13C6-Glucose为代谢底物进行稳定同位素标记的GC-MS和NMR分析发现：1）LNCaP PDHA1 KO细胞中葡萄糖来源的TCA循环中间代谢产物明显减少，糖酵解途径显著增强；2）以13C5，15N2-Glutamine为底物分析，可见谷氨酰胺明显补偿了PDHA1 KO细胞TCA循环中的多种中间代谢产物，其中累积的“Oncometabolite”延胡索酸主要来源于谷氨酰胺；3）LNCaP PDHA1 KO细胞中还原型谷胱甘肽的丰度较亲本细细胞显著减少。 第二部分：前列腺癌细胞中丙酮酸脱氢酶E1α缺失与谷氨酰胺代谢活化 研究方法： 1.采用葡萄糖测定试剂盒和谷氨酰胺测定试剂盒测定 LNCaP亲本细胞和PDHA1 KO细胞葡萄糖和谷氨酰胺消耗速率。 2.采用Western blotting手段，研究葡萄糖和谷氨酰胺分解通路中关键蛋白表达水平的变化。 3.通过进行谷氨酰胺剥夺（glutamine deprivation）实验，研究谷氨酰胺缺乏对前列腺癌细胞的相对生长速度（MTT法）和克隆形成能力的影响，流式细胞仪测定凋亡细胞比率和ROS产量，荧光素酶法测定胞内ATP产量，Seahorse Extracellular Flux96XFe能量代谢分析仪分析细胞内氧化磷酸化偶联的基础氧耗水平及线粒体呼吸功能储备的变化（Seashore Mito Stress Assay）。 4.使用选择性抑制剂 BPTES和 EGCG靶向抑制谷氨酰胺分解酶（GLS）和谷氨酸盐脱氢酶（GLUD1），以流式细胞仪测定凋亡细胞比例和ROS水平改变。 研究结果： 1. LNCaP PDHA1KO细胞中葡萄糖和谷氨酰胺消耗率较亲本细胞显著增加；糖酵解途径关键蛋白HK2和LDHA的蛋白表达水平显著上调；线粒体丙酮酸转运载体MPC1和MPC2蛋白表达量显著下调；此外，谷氨酰胺分解代谢通路中的关键酶GLS和GLUD1蛋白表达量均明显上调。 2.进行谷氨酰胺剥夺处理后，亲本细胞与和 PDHA1 KO细胞的增殖速率均受到明显抑制，凋亡细胞比例增加，胞内总 ROS水平增加。Seahorse Mitostress实验证明线粒体基础呼吸水平和呼吸储备功能下降。荧光素酶测定ATP产量降低。但以上指标在LNCaP PDHA1 KO细胞中的变化较亲本细胞更为显著。 3.与亲本细胞相比，使用相同剂量特异性抑制剂BPTES和EGCG能更显著地诱导LNCaP PDHA1 KO细胞凋亡和ROS积累。 第三部分：前列腺癌细胞线粒体丙酮酸载体抑制与谷氨酰胺代谢激活 研究方法： 1. UK5099为选择性MPC抑制剂，首先通过预实验确认优化的UK5099浓度。以此浓度的UK5099处理前列腺癌细胞DU145和LNCaP以抑制其MPC功能。利用GC-TOF-MS测定UK5099处理前后细胞内代谢谱的改变。 2.以谷氨酰胺测定试剂盒检测UK5099处理前后各组细胞对谷氨酰胺消耗的变化。Weatern blotting检测糖糖酵解关键酶LDHA以及谷氨酰胺分解通路关键酶GLS和GLUD1蛋白表达水平的变化。 3.谷氨酰胺剥夺前后，采用MTT法绘制细胞生长曲线。Seahorse Extracellular Flux96XFe能量代谢分析仪分析胞内线粒体氧化磷酸化偶联的氧耗水平变化（OCR）的变化，流式细胞仪测定细胞内总ROS产量。 研究结果： 1.采用合适浓度的UK5099抑制DU145和LNCaP细胞线粒体丙酮酸的转运后，导致了细胞内乳酸和天冬氨酸的丰度显著增加，同时谷氨酰胺和谷氨酸的丰度显著降低。 2. UK5099处理48 h之后的DU145和LNCaP细胞谷氨酰胺消耗显著增加，糖酵解关键酶LDHA和谷氨酰胺分解关键酶GLS和GLUD1蛋白表达量上调。 3.谷氨酰胺剥夺导致LNCaP和DU145细胞生长抑制，细胞内OCR降低，ROS产量增加。与对照组细胞相比，以上指标在MPC功能抑制的LNCaP和DU145细胞中明显增强。 第四部分：谷氨酰胺分解代谢通路关键酶表达水平与前列腺癌病人预后分析 研究方法： 1.利用免疫组织化学技术，检测88例前列腺癌石蜡标本组织中GLS和GLUD1蛋白表达情况。 2.应用SPSS18.0软件，采用χ2检验分析GLS和GLUD1蛋白表达与各临床病理学特征之间的关系；Kaplan-Meier和log-rank检验分析GLS和GLUD1蛋白表达水平与患者总生存期之间的关系。 研究结果： 1.在88例前列腺癌中，55例（63.2％）呈现GLS蛋白低表达；33例（36.8%）呈现高表达，GLS蛋白表达与Gleason评分(p=0.017)存在明显的相关性。在Gleason评分小于5分的45例患者中，15例（33.3%）高表达GLS蛋白，而在Gleason评分大于等于8分的19例患者中有12例（63.2%）高表达GLS蛋白。癌组织中低表达 GLS蛋白的前列腺癌患者总生存期间68.0月（95%CI：53.3-82.7），而高表达的患者中位生存期仅30.0月（95%CI：13.2-46.8）（p=0.001），差异具有显著统计学意义。 2. GLUD1蛋白的表达水平同样与Gleason评分(p=0.021)存在相关性；在Gleason评分大于和等于8分的患者中，高达84.2%比例的肿瘤组织高表达 GLUD1蛋白，低表达的患者总生存期间68.0月，而高表达的患者中位生存期仅为47.0月（p=0.023），差异同样具有统计学意义。 研究结论： 1.前列腺癌LNCaP细胞中PDHE1α的缺失导致糖酵解通路相对活化，同时细胞内谷氨酰胺分解通路激活。增强的谷氨酰胺代谢水平可部分补偿线粒体TCA循环。此外，PDHE1α功能缺失导致的癌相关代谢产物延胡索酸的胞内积累可能是丙酮酸代谢障碍所诱导的前列腺癌恶性转化的重要分子机制之一。 2.在体外培养的前列腺癌细胞中，MPC的功能抑制可严重影响丙酮酸进入线粒体的过程，结果导致谷氨酰胺分解通路的激活，并促进细胞形成嗜谷氨酰胺的代谢特性。 3.谷氨酰胺分解通路的关键蛋白GLS和GLUD1的高表达可作为前列腺癌的不良预后的指征之一。 综合以上研究提示，PDHE1α缺失或MPC功能抑制均可导致前列腺癌细胞中线粒体丙酮酸氧化代谢障碍。通过上调谷氨酰胺分解通路的关键蛋白GLS和GLUD1，线粒体内丙酮酸代谢活性的下降可同时激活补偿性的谷氨酰胺分解通路。此外GLS和GLUD1的高表达与前列腺癌患者的不良预后呈正相关，因此以上的研究提示MPC功能抑制或PDHE1α缺失导致的丙酮酸代谢障碍引起的谷氨酰胺代谢重编程效应可能促进了前列腺癌的恶性发展，而高度活化的谷氨酰胺分解途径可能是阻断这个过程的潜在靶点。