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口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus，FMDV)感染偶蹄动物所引起的急性、热性、高度接触性传染病。FMDV共有A、C、O、SAT1、SAT2、SAT3和AsiaⅠ七个血清型，每个血清型又有很多亚型，不同的亚型间几乎没有交义免疫原性。 FMDV衣壳具有由VP1、VP2、VP3和VP44种结构蛋白组成的正二十面体结构。其中VP1、VP2和VP3是FMDV的主要界面分子，FMDV的主要抗原位点存在于VP1第140～160位氨基酸处的G-H环上，富含B细胞表位，是四种结构蛋白中刺激机体产生体液免疫应答最主要的成分，但也是发生变异的主要区域，并且只利用VP1的这一个抗原表位作为抗原刺激动物所产生的免疫保护持续时间很短。除此之外VP1还富含T细胞抗原表位，由O型FMDV的VP1刺激牛所产生的CTL应答对其余6种FMDV的攻击具有保护作用，提示VP1上含有能够发挥交叉免疫保护的T细胞表位。VP4虽然位于衣壳内部，但也存在着T、B细胞表位，并且氨基酸序列比较保守，多种单体型的MHC均可识别VP4的20-34位氨基酸序列，因此VP4被认为是制备通用型FMD疫苗的首选抗原之一。基于此，我们设计了VP1-VP4融合蛋白，期望获得的FMDV抗原不仅能够有效刺激机体产生更加全面的免疫应答（包括体液免疫应答和细胞免疫应答），而且对于不同血清型的病毒能够表现出交叉免疫保护作用。 蛋白质泛素化现象在细胞内广泛存在，参与许多非常重要的生理功能，其中最早确定的功能是泛素介导的蛋白质降解。细胞内存在两条主要的蛋白质降解途径，分别为溶酶体途径和蛋白酶体途径。泛素化的不同类型决定了底物蛋白的命运。研究认为，多聚泛素化作用倾向于将底物蛋白运送到蛋白酶体内进行降解，其中以K11、K48连接的多聚泛素化为主，单链泛素化的蛋白质则倾向于由溶酶体降解。树突状细胞内存在的两种抗原提呈途径，MHC-Ⅰ类分子途径和MHC-Ⅱ类分子途径均与抗原在细胞内的泛素化类型密切相关，研究FMDV抗原在细胞内的泛素化类型用以反应其在细胞内的转运、降解途径是一种行之有效的方法。 本试验利用FK1、FK2两种抗体检测树突状细胞对重组FMDV VP1-VP4蛋白的泛素化类型。结果发现FMDV重组蛋白VP1-VP4在DCs内能够同时被单链、多聚泛素化，但是蛋白被多聚泛素化的水平明显高于单链泛素化水平。比较泛素化蛋白在不同时间点的含量发现3h和6h泛素化条带加深，表明被吞入内吞小体的VP1-VP4在1h后能够被转运至细胞质基质中。为了进一步探索造成此结果的可能原因，我们采用甘露聚糖竞争性抑制MR的活性，并用激光共聚焦荧光显微镜观察抗原在细胞内的动态变化。结果发现抑制MR后，BMDCs摄取VP1-VP4融合蛋白的量不仅没有降低反而升高了，提示MR在BMDCs摄取VP1-VP4蛋白过程中发挥着负调控的作用。为了验证泛素化作用对抗原提呈途径的影响，试验采用抑制剂分别阻断抗原提呈的MHC-Ⅰ分子途径和抗原提呈的MHC-Ⅱ分子途径。与不加抑制剂的正常组相比，当抑制MHC-Ⅰ分子途径后15min与30 min细胞内内吞小体的数目明显增多，通过内吞小体进入溶酶体的VP1-VP4蛋白的量也明显增加，至60 min后甚至出现了形态巨大的溶酶体小泡。表明使用抑制剂阻断抗原经过蛋白酶体途径的降解，造成经由溶酶体降解的抗原量明显增大。该结果证明重组FMDV VP1-VP4蛋白能够通过泛素化-蛋白酶体途径被细胞降解，BMDCs能够以交叉提呈途径来提呈FMDVVP1-VP4抗原。当抑制MHC-Ⅱ分子途径后，BMDCs摄取的VP1-VP4蛋白不能在溶酶体内被有效降解，随着时间的延长细胞内内吞小体/溶酶体不断融合数目增多，形态变大，VP1-VP4蛋白在细胞内随着时间延长而滞留下来。由此可以证明，FMDV VP1-VP4融合蛋白能够在溶酶体中被降解，MHC-Ⅱ类分子提呈途径是BMDCs提呈FMDV VP1-VP4抗原的重要途径。 本次试验利用western bloting、激光共聚焦荧光显微镜成像技术第一次以直观的形式将BMDCs加工、提呈FMDV VP1-VP4抗原的途径展现出来，研究发现FMDV VP1-VP4融合蛋白在BMDCs内能够同时被单链、多聚泛素化，并且能够同时通过溶酶体途径和蛋白酶体途径被降解。这些结果进一步阐明了机体抗FMDV免疫应答的分子机制，可为新型疫苗设计提供理论指导。