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在老年骨折患者中,骨折愈合延迟、不愈合和内固定失败等并发症的发生率相对较高。由于老年患者合并基础疾病(如心脑血管疾病、中枢神经系统疾病和糖尿病等)的情况常见,不能耐受长时间制动,造成临床上老年骨折预后往往不理想。此外老年骨折患者住院时间长,需要进行专门的护理,在患者遭受病痛折磨的同时,还给患者家属和社会增添了巨大的经济负担。随着我国老年人口的增多,老年骨折患者的发病人数日趋上升,如何更好的治疗老年骨折是骨科学界面临的重大课题。骨折修复能力下降是老年骨折愈合延迟或愈合不良的主要原因。动物实验研究发现,老年大鼠骨折愈合过程较年轻大鼠明显滞后。老年大鼠骨折后骨痂的出现时间晚,矿化速度慢,生物力学指标和骨密度指标不能达到正常范围。形态学方面研究发现,老年大鼠骨折愈合机制的异常主要表现在:骨膜反应滞后、细胞分化延迟、骨形成减少,软骨内血管生成推迟、软骨的骨化过程减弱。形态计量学研究证明,年龄增大使老年大鼠的骨形成面积减少,但软骨形成过程基本正常。细胞学研究发现,随年龄增大骨髓基质干细胞的数量减少,骨髓基质干细胞在骨折环境的刺激下可能会分化为脂肪细胞而不是成骨细胞,同时这些干细胞的传代能力减弱。对骨折发生后局部组织的mRNA定量分析发现,老年大鼠骨折后局部BMP-2、4、7等骨诱导因子的蛋白表达减少,表达上调的时间短于骨折愈合需要的时间。这些研究从不同层次对老年大鼠的骨折愈合过程加以研究,说明老年骨折愈合机制不同于我们通常了解的骨折愈合过程,有必要对其进行专门的研究。老年骨折和骨质疏松骨折有密切联系,但二者不完全相同,这主要表现在以下两方面。一方面骨质疏松并非都发生在老年,另一方面老年骨折后愈合不佳的病例并非都伴有骨质疏松症。研究发现,骨密度正常的老年人发生骨折的几率仍然高于年轻人群,这可能和骨组织中的胶原排列紊乱有关。胶原的正常数量和结构是维持骨骼正常强度的重要因素,而这时骨质的矿化程度并没有发生明显改变,即骨密度正常。在骨质疏松动物模型的实验中,骨折的愈合也可以表现为正常过程。对骨髓基质干细胞的研究发现,骨质疏松症患者或动物模型来源的干细胞的数量和活性可以表现正常,这一点和老年化的骨髓基质干细胞普遍异常不同。在对老年骨质疏松症患者施予药物治疗后,骨质疏松症可能逐步改善,骨折的风险可能降低,但是当骨折发生后,骨折的愈合过程仍然延迟,即骨折的愈合能力并没有明显改善。上述研究说明,简单的用骨质疏松来解释老年骨折愈合机制的异常是不够准确的。基因治疗是促进骨折愈合重要的生物学方法,也是目前骨创伤修复研究的主要方向。通过基因载体转导或转染,使骨折局部BMPs等骨诱导因子增加,从而加速和改善骨折的愈合已被证实是有效的。但是以往研究中一般应用病毒基因载体,由于存在安全隐患,使基因治疗缺乏实用性。上世纪90年代,Bossif等发现高分子多聚物聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)可以转载基因DNA进入受体细胞。之后各国学者对PEI展开了广泛的研究,结果发现PEI具有高效、安全、可控性好、易修饰,以及廉价、易于操作等优点,在基因治疗中有广阔的应用前景。PEI已成为非病毒载体中研究最快的领域之一。在此背景下,本课题设计利用纳米阳离子多聚物PEI(13KDa,高分枝)为基因载体,介导已被证实具有较强骨诱导活性的BMP-7基因,通过体内(in vivo)转染的方式,对老年大鼠的骨折修复过程加以干预,希望找到一个高效的、具有一定实用性的促进骨折愈合的生物学方法,为增强老年骨折修复能力、改善老年骨折预后的研究作出贡献。第一部分:PEI介导的体外基因转染的实验研究1对PEI的细胞毒性进行检测。通过MTT法观察不同浓度PEI对培养细胞存活率的影响,对PEI的安全性加以评价。结果PEI在测试浓度范围内对细胞的存活率没有明显影响。2检测PEI的粒径特征。应用透射电子显微镜观察PEI微粒、PEI和DNA混合物微粒的微观形态,PEI在良好的分散状态下表现为均匀的多分支形态,PEI和pEGFP-N1形成的混合物微粒表现为均匀的类球形。应用动态光散射法观察PEI和PEI/DNA复合物的粒径,结果显示PEI微粒的粒径在70nm左右,浓缩DNA形成的复合物粒径119nm左右。3PEI结合DNA的凝胶电泳实验。按照不同比例将PEI和目的基因pEGFP-N1混合,通过琼脂糖凝胶电泳观察不同比例PEI和质粒DNA形成复合物的泳动速率,检测PEI结合DNA的能力及最佳比例范围。4PEI转染效率的检测。按照不同比例应用PEI转染试剂介导pEGFP-N1体外转染NIH3T3细胞,计算转染效率,寻找PEI的最佳转染条件。以阳离子脂质体LipofectAMINE2000为对照,评价PEI的转基因能力。结果发现PEI在体外转染的最佳比例是其体积(浓度固定时)和质粒DNA的比值为3。PEI的转染效率和阳离子脂质体Lipo2000比较没有统计学差异。结论:PEI的粒径复合纳米载体的特征。对细胞的毒性很小,在体外转染条件下有较高的安全性。能充分结合质粒DNA。体外转染效率较高,转染效率和PEI与DNA的比值有关。PEI时安全高效的非病毒基因载体。第二部分:PEI介导的BMP-7基因转染成纤维细胞的实验研究1获得BMP-7基因片段的全长序列并构建真核表达载体。从人骨肉瘤细胞U2 OS中,抽提总mRNA。设计引物,通过RT-PCR从总mRNA抽提产物中扩增BMP-7基因的cDNA全长片段。用酶切电泳鉴定片段长度。将PCR产物连接至pcDNA3.1真核表达质粒。对构建产物进行酶切电泳和测序鉴定序列的完整和准确性。结果:通过RT-PCR获得了完整的BMP-7cDNA序列,酶切片段长度显示其大小在1000bp和2000bp之间,与BMP-7基因长度吻合。测序结果显示基因序列完整准确。构建真核表达载体pcDNA3.1-BMP-7经酶切、电泳证实载体构建成功。2利用PEI介导BMP-7基因转染成纤维细胞。按照常规方法培养NIH3T3细胞,PEI与pcDNA3.1-BMP-7质粒按照第一部分检测结果提示的比例混合,转染NIH3T3细胞,通过Wextern-blot方法检测成纤维细胞表达BMP-7的变化。结果:转染后24-48小时Western-blot检测细胞表达的BMP-7蛋白明显增加,证明PEI成功将目的基因转入并表达。成纤维细胞可以作为种子细胞被转入BMP-7基因并表达,使细胞外BMP-7蛋白含量增高。结论:通过RT-PCR方法从人骨肉瘤细胞总mRNA中扩增的BMP-7cDNA片段完整。利用PEI转染试剂能够成功在体外将真核表达载体pcDNA3.1-BMP-7转入NIH3T3细胞。成纤维细胞合成分泌BMP-7蛋白。该实验为利用PEI介导BMP-7基因促进骨折愈合奠定了理论基础。第三部分:PEI介导EGFP基因体内转染小鼠肌肉细胞的实验研究大量制备pEGFP-N1质粒。将试验动物(昆明小鼠)随机分为三组,一组为试验组,两组为对照。通过直接注射方法,利用PEI转染试剂介导pEGFP-N1质粒DNA直接转染实验组小鼠大腿肌肉组织。分别用总体积相同的PBS和pEGFP-N1质粒DNA为对照。标本经冰冻切片后在激光聚焦显微镜下观察转染情况,计算转染效率。结果:利用PEI转染试剂能够成功的将增强GFP基因转入小鼠肌肉组织内。EGFP蛋白的表达情况随转染后时间变化。转染后24小时即可观察到绿色荧光,第3天达到最高,第8天基本消失。对照组基本为阴性表现。结论:本实验结果证明,通过直接经皮注射的方法,PEI载体能够成功将绿色荧光蛋白基因转入小鼠肌肉组织内,并且没有明显的副作用。在体内转染的基因治疗中可以利用PEI作为基因载体。第四部分:PEI介导的BMP-7基因体内转染对老年大鼠骨折愈合影响的实验研究建立老年大鼠股骨骨折的动物模型。将实验动物随机分为实验组(PEI载体介导BMP-7基因治疗组)和对照组B(生理盐水对照组)、C(BMP-7质粒对照组)。通过直接注射的方法,利用PEI载体介导BMP-7基因转染入大鼠骨折骨折端。骨折后2、4、8周分别摄X光片、取骨痂标本作HE染色、Ⅰ型胶原染色,观察骨折愈合情况。骨折后第8周,取完整股骨标本作骨密度检测和抗弯曲生物力学检测,观察骨折愈合质量。结果:第8周老年大鼠骨折仍未完全愈合。与对照组相比,实验组骨痂组织出现时间早,软骨面积较大,软骨骨化过程相对较早,成骨面积增大。实验组骨痂的骨密度和抗弯曲生物力学指标均优于对照组,骨痂质量明显改善。结论:利用PEI载体介导BMP-7基因体内转染骨折端,能够加快老年大鼠的骨折愈合速度,改善骨折愈合质量,缩短老年大鼠骨折愈合时间。通过直接注射方式的体内基因治疗,可以对老年大鼠的骨折愈合过程发挥作用。PEI载体介导的体内基因治疗方法,在促进老年大鼠骨折愈合研究领域具有重要的价值和广阔的应用前景。