论文部分内容阅读
目的:本论文旨在对比研究两种肝纤维化动物模型，选择较理想的肝纤维化模型，通过体内药效学实验研究藏药郎庆阿塔对肝纤维化的治疗作用，并且结合体外细胞实验初步探讨藏药郎庆阿塔抗肝纤维化可能的作用机理。
方法:
1.采用复合因素法和免疫血清法构建大鼠肝纤维化模型，分别造模6周和10周，于造模结束后，次日空腹采血，检测各组大鼠血清ALT、AST水平，处死大鼠，取肝脏进行肝组织病理学检查，评价肝纤维化大鼠模型的炎症、纤维增生及胶原沉积情况，比较两种肝纤维化大鼠模型的异同，选择较理想的动物模型进行后续实验。
2.参照复合因素肝纤维化造模方法制备大鼠肝纤维化模型，按照血清ALT、AST指标将模型大鼠随机分为模型组、阳性药组、郎庆阿塔高、中、低剂量组，另设正常组。各组大鼠于分组后即日（第7周）开始灌胃给药，每日一次，连续灌胃给药7周。郎庆阿塔高、中、低剂量组灌胃给予郎庆阿塔药液11.4、5.7、2.85g生药/kg，阳性药组灌胃给予复方鳖甲软肝片0.55g/kg，正常组及模型组均灌胃给予等容积蒸馏水。除正常组外，其余各组大鼠继续以皮下注射四氯化碳维持造模4周，共造模10周。于末次给药后次日空腹采血，以全自动坐化分析仪检测血清中AST、ALT、ALP、T-Bil、TP、ALB、A/G指标，以放免法检测血清中肝纤维化指标LN、CIV、HA、PⅢNP，采血后处死动物并取肝脏，称重计算脏器系数，并取肝组织，测定其羟脯氨酸含量、SOD活力及MDA水平，另取肝组织标本经10％福尔马林液固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察各组大鼠肝组织的病理改变情况，并采用Masson染色观察肝组织内纤维化程度，采用HIAPS-2000型图象分析系统定量肝组织中胶原面积，以免疫组化法检测肝组织中TGF-β1和α-SMA的表达水平，以荧光定量PCR法测定肝组织中CoL-Ⅰ和CoL-ⅢmRNA的表达情况，采用透射电镜观察肝组织超微结构变化。通过本章实验研究郎庆阿塔治疗肝纤维化作用，并初步探讨其作用机理。
3.体外情况下，以不同浓度郎庆阿塔药液作用于HSC-T6，MTT法检测郎庆阿塔对HSC-T6细胞增殖的影响，经IC50软件计算其IC50值，采用细胞划痕实验观察郎庆阿塔对HSC-T6细胞迁移的影响，DAPI染色观察郎庆阿塔作用后HSC-T6细胞的细胞核变化。
结果:
1.复合因素法和免疫血清法造模后，各造模大鼠体重均低于正常组(P＜0.05～0.01)，血清ALT、AST水平明显升高(P＜0.05～0.01)，病理组织学检查发现，复合因素法大鼠肝组织纤维增生明显，将肝组织分割成多个假小叶，可见大量炎症细胞浸润，免疫血清法造模大鼠肝组织可见纤维增生。结果表明，复合因素法肝纤维化模型大鼠纤维化程度比免疫血清法严重，病变较典型，是一种较理想的肝纤维化动物模型，可依此造模进行后续实验研究。
2.参照第二章中复合因素法造模，并给予郎庆阿塔后发现，各给药组大鼠的体重呈增长趋势，郎庆阿塔能够剂量依赖性地降低肝纤维化大鼠的肝脏系数和肝组织中羟脯氨酸含量(P＜0.05～0.01)，能显著降低肝纤维化大鼠血清AST、ALT、ALP、T-BIL、HA、LN、PⅢNP及CIV水平(P＜0.05～0.01)，升高ALB和A/G比值，能明显升高肝组织中SOD活力(P＜0.05～0.01)、降低MDA水平(P＜0.05～0.01);病理组织学检查结果表明，郎庆阿塔高、中剂量对肝纤维化大鼠肝组织纤维增生、炎症活动度均有显著的改善作用(P＜0.05～0.01)，并能显著降低肝组织中胶原面积(P＜0.05～0.01);免疫组化结果发现，郎庆阿塔能明显降低肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β1和α-SMA的表达水平(P＜0.05～0.01);荧光定量PCR结果表明，郎庆阿塔还能降低肝纤维化大鼠肝组织中CoL-Ⅰ和CoL-ⅢmRNA的表达水平(P＜0.05～0.01);电镜检查结果显示，郎庆阿塔高剂量和复方鳖甲软肝片能够减少活化的HSC，显著改善肝纤维化大鼠的胶原沉积。上述结果表明，郎庆阿塔能够治疗肝纤维化，其作用可能与减少活化的HSC、下调CoL-Ⅰ和CoL-ⅢmRNA的水平、抑制胶原沉积、降低TGF-β1和α-SMA的表达有关。
3.体外培养HSC-T6细胞，MTT检测细胞增殖情况发现，郎庆阿塔能够明显抑制HSC-T6细胞的增殖，其IC50值为3.89mg/mL;细胞划痕实验显示，郎庆阿塔处理后，HSC-T6细胞的迁移减弱;DAPI染色结果发现，正常组HSC-T6细胞细胞核呈类圆形或椭圆形，染色均匀，而郎庆阿塔处理组，细胞核皱缩变小，点状荧光增强，表明HSC-T6细胞活性受到抑制。
结论:根据以上结果可知，藏药郎庆阿塔能够降低血清肝纤指标，改善肝纤维化大鼠肝组织的炎症及纤维化程度，具有明显的治疗肝纤维化作用，其抗肝纤维化功效可能与其抑制肝星状细胞的活性，下调CoL-Ⅰ和CoL-ⅢmRNA的水平，减少胶原沉积、降低TGF-β1和α-SMA的表达有关。