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肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。近年来以嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)和免疫检查点抑制剂型抗体为代表的肿瘤免疫治疗技术为肿瘤的治疗带来了革命性的进步。免疫检查点是表达在免疫细胞(T细胞、单核/巨噬细胞)表面的一类调节蛋白,肿瘤细胞表面高表达的抑制性配体与免疫检查点蛋白结合后可以抑制免疫细胞的活性,帮助肿瘤细胞逃避免疫系统的监视。靶向免疫检查点的单克隆抗体可以阻断肿瘤细胞对免疫细胞的抑制作用,强化免疫细胞的抗肿瘤活性。目前已经有多个靶向免疫检查点CTLA-4和PD-1的单抗药物被FDA批准,还有更多的免疫检查点被陆续鉴定,这些新的免疫检查点是抗体药物研发的重要靶点,TIM-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3)就是其中的一个代表。TIM-3最初发现表达在产生IFNγ的CD4~+辅助性T细胞(Th1)和CD8~+杀伤性T细胞(Tc1)上,后来在Th17细胞、Treg细胞和先天免疫细胞(DC、NK细胞、单核细胞)上也发现了TIM-3的表达。TIM-3的配体是Galectin-9(beta-galactoside lectin protein),后者高表达于淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤类型中。Galectin-9与TIM-3结合后能够引起T细胞的功能耗竭。靶向TIM-3的单克隆抗体能阻断这个过程的发生。传统的单克隆抗体有VH和VL两个抗原结合域,分子量比较大,而小型化的VH单域抗体(domain antibody)具有多方面的独特优势,比如更强的组织渗透性(tissue penetration),更容易改型和用以构建多特异性抗体等。在抗体药物研发中最具吸引力的单域抗体是骆驼来源的VHH抗体(也称纳米抗体)、人源和兔源的VH domain。本课题的主要研究内容是以TIM-3为靶点,采用重组TIM-3蛋白免疫家兔和噬菌体展示相结合的技术,制备靶向TIM-3的VH单域抗体,为研发小型化的TIM-3抗体药物奠定基础。取得的主要结果如下。1)克隆了TIM-3和Galectin-9的cDNA,构建了TIM-3胞外域、Galectin-9全长蛋白的表达质粒和TIM-3全长蛋白的慢病毒表达载体。以人胚肾细胞HEK293F细胞为表达系统,表达纯化了TIM-3胞外域和Galectin-9蛋白。以慢病毒为载体,构建了超表达TIM-3全长蛋白的A431细胞。2)以TIM-3胞外域作为免疫原,免疫家兔,获得了效价超过100000的兔多抗血清。3)以免疫后家兔的脾脏为材料,提取总RNA,经过反转录和PCR扩增,构建了噬菌体展示的兔VH单域抗体文库,最后经过TIM-3胞外域亲和淘选,获得了5个TIM-3特异性的VH单域抗体序列,分别命名为TIM3-R1,TIM3-R6,TIM3-R23,TIM3-29,TIM3-R53,从序列多样性看,代表了3种明显不同的结构类型(R1,R23,R53)。4)利用大肠杆菌和哺乳动物细胞细胞表达系统,表达纯化了这些单域抗体,采用ELISA、Western Blot、Flow Cytometry等方法确定了TIM-3单域抗体结合重组TIM-3蛋白和细胞膜TIM-3蛋白的亲和力和特异性。根据ELISA方法测得的单域抗体对重组TIM-3的Kd值(EC50)范围为278-8740nM,结合活性最强的为R53,Kd值为278 nM,而重组Galectin-9在同样条件下对TIM-3的Kd值经测定为204 nM,其余单抗的亲和力均低于Galectin-9。Flowcytometry证实R53单抗具有明显的细胞结合活性。5)ELISA竞争结合实验显示,2个TIM-3单抗(R23,R53)能够阻断Galectin-9和TIM-3的结合,R53的阻断活性强于R23,两者在1-200μg/mL的范围呈现浓度梯度依赖性的阻断效应。其余3个单抗没有显示出阻断活性。6)以CAR-T细胞为模型,在细胞水平上研究了TIM-3单抗对CAR-T细胞肿瘤杀伤活性的影响。通过激活PBMC细胞,CAR病毒感染PBMC细胞,构建CAR-T细胞,流式分析证实CAR-T细胞能够表达TIM-3。将TIM-3单抗与CAR-T细胞、带有Luciferase标记的H9肿瘤细胞共同孵育,结果发现,R53单抗在10ng/mL以上的浓度下可以显著提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性,肿瘤杀伤活性提高了25%。7)以移植瘤小鼠为模型,研究了R53单抗在小鼠体内对CAR-T细胞抑瘤活性的影响。在裸鼠皮下接种表皮癌H9细胞,待成瘤后,分别用CAR-T细胞、CAR-T细胞联合R53单抗进行治疗,观察肿瘤生长速率,结果发现TIM-3单抗可以提高CAR-T细胞的抑瘤活性,TIM-3单抗联合CAR-T治疗可以使肿瘤的生长速率更缓慢。总之,本课题成功地制备了能够阻断Galectin-9和免疫检查点TIM-3结合的单域抗体,并对这些单域抗体的性质和抗肿瘤活性进行了初步的研究,这些研究结果将为研发靶向TIM-3的肿瘤治疗性抗体奠定坚实的基础。