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林蛙骨是林蛙加工的副产物,含有丰富的骨蛋白。本研究以林蛙骨为原料,采用超声波辅助提取技术(UAE),对林蛙骨酶解前预处理中脱脂工艺进行优化,并与预处理前后的林蛙骨进行对比;筛选两种蛋白酶对林蛙骨进行分步酶解,制备抗氧化肽;对不同分子量林蛙骨肽的抗氧化活性进行测定;以活性最高的肽段为原料制备林蛙骨肽咀嚼片。主要研究结果如下:(1)林蛙骨脱脂预处理:用超声波辅助脱脂技术对林蛙骨进行预处理,以蛋白含量和脂肪残余量为指标,对比液料比、超声温度、超声时间进行单因素优化试验,并进行响应面优化试验。所得最优工艺条件为:液料比为6m L/g,超声温度38℃,超声时间21min,在此预处理条件下所测得林蛙骨蛋白含量为48.53%,比预处理前和预处理未超声的林蛙骨分别高了21.90%和11.64%,脂肪残余量为0.98%,比预处理前和未超声预处理的林蛙骨分别降低了86.85%和81.92%,水解度也比另两组分别高75.83%和32.78%;结构分析表明,预处理对林蛙骨蛋白的二级结构没有显著影响,但会改变骨粉表面的微观结构,使骨粒表面结构疏松,利于后续酶解的进行和水解度的提高。(2)双酶分步水解林蛙骨制备抗氧化肽:通过单酶水解优选出中性蛋白酶和碱性蛋白酶对林蛙骨进行分步水解。先选择中性蛋白酶,以水解度为指标,对料液比、加酶量、p H值、酶解时间进行单因素优化试验,并进行正交优化试验,所得一次酶解最优工艺条件为:料液比为1:30,加酶量为7%,p H值为6.5,水解时间为100min,在此工艺条件下,林蛙骨粉的水解度为26.81%。选择碱性蛋白酶,对林蛙骨一次水解液进行二次酶解,以水解度和DPPH自由基清除率为指标,对加酶量、p H值、酶解时间进行单因素优化试验,并进行响应面优化试验,所得林蛙骨二次酶解最优工艺条件为:加酶量为5.57%,p H值为8.94,酶解时间为97min,在该条件所得林蛙骨水解度和DPPH自由基清除率分别为41.89%和90.43%。(3)林蛙骨肽的分离及抗氧化活性的测定:对林蛙骨肽酶解液进行超滤分离,得到未超滤,>30k Da,10~30k Da,3~10k Da,1~3k Da,<1k Da六种不同分子量的组分,并通过测定DPPH自由基清除率、还原力、金属离子螯合能力、羟自由基(·OH)清除率和总抗氧化活性五个指标,对其抗氧化活性进行评价。结果表明,DPPH自由基清除率和还原力较高的都为1~3k Da,3~10k Da和<1k Da,金属离子螯合能力较强的为<1k Da和1~3k Da,·OH清除率较强的为<1k Da,总抗氧化活性较强的为1~3k Da和3~10k Da。不同指标的测定结果差异不大,抗氧化活性最高的肽段都集中在<10k Da范围内,且低分子量的林蛙骨肽比高分子量的抗氧化活性高,因此,选择分子量<10k Da的林蛙骨肽进行后续产品的研究。(4)林蛙骨肽咀嚼片制备:选取湿法造粒工艺,以颗粒成品率为指标,对混合料的干燥温度、干燥时间、PVP乙醇浓度进行单因素优化试验,并进行正交优化试验,所得林蛙骨肽咀嚼片造粒最优工艺条件为:干燥温度60℃,干燥时间90min,含10%PVP的乙醇浓度50%,在此条件下所得颗粒成品率为92.81%。对林蛙骨肽咀嚼片配方进行优选,对肽奶粉、矫味剂、酸味剂的种类进行优选,并对各自优选出的添加量进行单因素优化试验,进行正交优化试验,所得林蛙骨肽咀嚼片最优配方为:肽奶粉20%,山梨糖醇40%,苹果酸3%,淀粉25%,甘露醇12%。所得林蛙骨肽咀嚼片感官评分为92.4,产品外观呈圆形,表面光滑,乳白色,色泽均匀,奶香适宜,无腥味,酸甜可口,口感滑腻,软硬适中,无颗粒感,质量差异和微生物指标符合国家标准,硬度等质构指标与市售奶片无明显差异,且适宜在常温干燥或密闭环境中保存。