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目的:B7-H3作为B7家族的最新成员,其受体在活化的T细胞表面可被诱导表达,B7-H3对CD4+和CD8+细胞的生成均具有增加作用,并可选择性的增加IFN-γ的生成。为将B7-H3基因转染入口腔鳞癌细胞Tca8113中制备瘤苗,我们克隆人共刺激分子B7-H3基因,构建其真核表达载体(pEGFP-C1-B7-H3),把pEGFP-C1-B7-H3转染到口腔鳞癌Tca8113细胞中,并检测B7-H3基因在转染鳞癌细胞Tca8113中的表达。方法:采用无菌肝素抗凝新鲜健康人全血,经淋巴细胞分离液梯度密度离心分离淋巴细胞,在含IFN-γ1×106U/L、10%小牛血清的RPMI-1640中培养1d,然后用Trizol提取总RNA。用RT-PCR方法将B7-H3的编码序列cDNA扩增。然后将该基因的编码序列插入到真核荧光蛋白载体pEGFP-C1中,构建成最终的真核表达载体pEGFP-C1-B7-H3。运用脂质体方法将pEGFP-C1-B7-H3转染到口腔鳞癌细胞Tca8113中,转染24h、36h、48h后,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,待转染成功后,用RT-PCR检测基因B7-H3在转染细胞中的表达;用Western blot检测其蛋白的表达。以丝裂霉素C(MMC)处理后,用有限稀释法建立稳定高表达的带有B7-H3基因的Tca8113鳞癌细胞株。结果:从人淋巴细胞中提取RNA A260/A280的比值为1.8,通过凝胶电泳鉴定,证实RNA的完整性符合RT-PCR要求。PCR产物电泳结果表明,B7-H3的RT-PCR扩增产物的大小约951kb,与预计B7-H3cDNA的大小一致。挑取酶切阳性的克隆进行DNA序列测定,应用Blast软件与GenBank中人B7-H3序列进行同源性比较,同源性为100%。经Bsp119I和XhoI双酶切对EGFP-C1-B7-H3重组质粒酶切鉴定表明,pEGFP-C1-B7-H3在凝胶电泳上显示两片段分别约1.0kb和4kb。证明重组质粒pEGFP-C1中已经克隆入B7-H3目的基因。用Trizol从转染pEGFP-C1-B7-H3了的Tca8113细胞中提取总RNA,然后用RT-PCR检测B7-H3的表达。PCR产物电泳结果表明,扩增产物的大小约215bp,与预期的大小一致。转染空载体pEGFP-C1的Tca8113细胞中,没有检测到215bp的PCR产物。用Western blot方法抽提B7-H3/Tca8113基因转染细胞,DAB显色,裂解已转染pEGFP-C1-B7-H3的Tca8113细胞(B7-H3/Tca8113)的基因转染细胞膜蛋白中相对分子质量约65～86KD大小的特异性条带;而mock/Tca811没有特异性条带。用脂质体2000细胞转染试剂盒把pEGFP-C1-B7-H3载体转入口腔鳞癌细胞株Tca8113中,24h、36h、48h左右在10×20倍倒置显微镜下用荧光观察细胞(光波波长488nm或513nm),同时与未转染质粒的口腔鳞癌细胞Tca8113做对照。转染B7-H3的Tca8113细胞,经过细胞传代培养后仍然能够检测到高表达的B7-H3基因,经过有限稀释法建立了B7-H3/Tca8113细胞株。结论:酶切及RT-PCR证实成功构建人B7-H3的真核表达载体pEGFP-C1-B7-H3,用脂质体法把该载体转染到口腔鳞癌细胞Tca8113中,用RT-PCR及Western blot鉴定B7-H3基因在该细胞中有表达。用有限稀释法建立了B7-H3/Tca8113细胞株,为以后的体内外试验提供了很好的平台,为将B7-H3基因转导入肿瘤细胞制备瘤苗以及研究B7-H3对免疫细胞的调节和肿瘤基因治疗奠定了基础。