论文部分内容阅读
甘蓝型油菜（Brassica napus）是我国重要的油料作物，而菌核病(Sclertiniasclerotiorum(Lib.) de Bary)是油菜生产最主要的限制因子，严重威胁着我国的油菜生产。目前，人们关于B.napus对S.sclerotiorum的抗病机制仍不甚了解。在对各种寄主和病原菌相互作用的研究中已经显示，植物WRKY转录因子在寄主抗病性中起着重要作用，然而，对于WRKY转录因子在B.napus与S.sclerotiorum互作中的抗病机制仍没有研究或未见报道。 本研究从B.napus中克隆了一个编码WRKY转录因子的基因BnWRKY33，序列分析显示，其编码蛋白BnWRKY33含有两个WRKY结构域和5个MAPK激酶磷酸化位点，且有一个在与VQ蛋白相互作用中起关键作用的天冬氨酸残基。诱导表达实验显示，油菜被菌核病侵染后Bn WRKY33迅速上调表达，茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)诱导时Bn WRK Y33也有不同程度地响应表达。结果表明，Bn WRKY33是菌核病侵染的响应基因。 为了进一步研究Bn WRKY33的抗菌核病功能，本研究构建了BnWRKY33植物表达载体1300-35S-WRKY33-NOS，使用In planta Agrobacterium-mediated方法转化油菜，并经潮霉素筛选和PCR检测，鉴定获得17个独立的转基因株系。本研究选择了经RT-PCR表达分析鉴定出的3个独立的Bn WRKY33过表达转基因株系用作后续分析。 抗病鉴定实验显示Bn WRKY33过表达油菜转基因植株对菌核病的抗性显著增强。qRT-PCR表达分析显示，当BnWRKY33高表达时，茉莉酸防卫反应标志基因BnPDF1.2和水杨酸防卫反应标志基因BnPR1显著上调表达;DAB组织染色实验显示，当S.sclerotiorum侵染时，Bn WRKY33的过量表达显著抑制H2O2的积累。进而，我们从B.napus中分离了一个MAPK激酶底物基因BnMKS1，发现BnMKS1具有4个保守结构域和10个MAPK激酶磷酸化位点，在第二个高度保守的结构域中，含有1个较短的FxxxVQxLTG VQ蛋白基序，表明BnMKS1属于VQ蛋白家族。酵母双杂交实验证明，BnMKS1能够与BnMPK4和BnWRKY33直接相互作用，而BnMPK4和BnWRKY33不能直接相互作用。在烟草叶片和油菜子叶中的瞬时表达实验均显示这三个蛋白都定位于细胞核。同时，诱导表达分析显示它们对菌核病侵染表现为协同应答。 本研究表明，Bn WRKY33在油菜抗菌核病分子机制中具有着重要作用，并且首次提出油菜抗菌核病的一个潜在机制:在油菜中，BnMPK4、BnMKS1和BnWRKY33以三聚体复合物的状态存在于细胞核中来调控Bn WRKY33靶基因的表达，进而调节水杨酸、茉莉酸防卫反应和氧化还原平衡来防御菌核病的侵染。本研究的开展有助于我们理解植物抗菌分子机制，为我们研究如何防御S.sclerotiorum引起的病害提供线索。