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失眠是临床常见的一种睡眠障碍性疾病,影响人类日间的生活与工作,除此之外,还会诱发心脑血管疾病、精神疾病等。失眠的发病机制较为复杂,涉及的脑部结构包括大脑皮层、脑干、海马、下丘脑、视交叉上核等,与睡眠-觉醒节律及中枢神经系统内的神经递质有密切关系,包括5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺(DA)、高香草酸(HVA)等单胺类神经递质及Y-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)等氨基酸类神经递质。目前用于治疗失眠的西药多存在耐药性、成瘾性等副作用。中国传统医学治疗失眠症的方法历史悠久,很多单味中药及中药复方都具有治疗失眠症的良好效果,深受人们的青睐。栀子厚朴汤出自《伤寒论》,由栀子、厚朴、枳实3味药材组成,主治热扰胸膈之失眠,是治疗失眠症的经方之一,但其作用机制尚不明确。基于以上,本研究拟在优化栀子厚朴汤提取工艺的基础上,建立对氯苯丙氨酸(PCPA)致失眠小鼠模型,通过高效液相色谱法测定小鼠大脑皮层、脑干、海马组织中单胺类神经递质的含量,采用液质联用仪的方法测定小鼠血清中氨基酸类神经递质的含量,分析单胺类神经质、氨基酸类神经递质与栀子厚朴汤治疗失眠之间的关系,初步探讨栀子厚朴汤治疗失眠的作用及机制。以睡眠剥夺果蝇为研究对象,采用PySolo活动监测系统,分析栀子厚朴汤及其不同提取部位对果蝇睡眠的干预作用,筛选栀子厚朴汤治疗失眠的有效部位群,并测定果蝇头部单胺类神经递质的含量,以期更为深入的探究栀子厚朴汤治疗失眠的作用机制。1.正交试验法优化栀子厚朴汤的提取工艺本实验采用正交试验法,建立了高效液相色谱法同时测定栀子厚朴汤中栀子苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、和厚朴酚、厚朴酚含量的方法,以各成分提取量及浸膏收率为指标,优化了栀子厚朴汤的提取工艺,获得的最佳提取工艺为12倍量体积分数为700%的乙醇浸泡60min后加热回流提取90min。验证实验表明,采用优选的工艺条件加热回流提取栀子厚朴汤,各主要成分含量及浸膏得率均较高,且稳定。2.栀子厚朴汤对失眠模型小鼠的行为学及组织中神经递质的影响本实验建立了腹腔注射PCPA致失眠小鼠模型,以宏观体征、体质量变化、翻正反射实验为指标,对所建模型进行评价,并通过HPLC-ECD测定小鼠大脑皮层、脑干、海马组织中单胺类神经递质5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)及其代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、高香草酸(HVA)的含量,通过LC-MS/MS测定小鼠血清中氨基酸类神经递质γ-氨基丁酸(GABA)、谷氨酸(Glu)的含量。结果表明,连续2天腹腔注射PCPA可成功复制失眠模型,且失眠模型小鼠经给予栀子厚朴汤后睡眠情况得到改善,其皮层、脑干、海马组织中DA的量显著降低、5-HT的量显著升高,血清中Glu/GABA显著降低。3.基于果蝇为模式生物的栀子厚朴汤治疗失眠的有效部位群筛选及作用机制研究本实验以7日龄处女果蝇为研究对象,通过夜间重复光照刺激的造模方法建立睡眠剥夺模型,采用PySolo活动监测系统,以果蝇的活动为指标,筛选栀子厚朴汤治疗失眠的有效部位群,并通过HPLC-ECD方法测定果蝇头部单胺类神经递质DA、5-HIAA、HVA、5-HT的含量。结果表明,光照刺激法可成功睡眠剥夺模型,一定剂量的栀子厚朴汤及其石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位对睡眠剥夺果蝇的睡眠具有改善作用,并且能够降低睡眠剥夺果蝇脑内DA及HVA的含量,提高5-HT及5-HIAA的含量,其中二氯甲烷部位的作用尤其明显。综上所述,栀子厚朴汤治疗失眠症的作用确切,可明显改善失眠模型小鼠及睡眠剥夺果蝇的睡眠情况,有效部位群包括石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位,其中二氯甲烷部位可能为主要有效部位群,推测其可能通过调节机体内单胺类神经递质及氨基酸类神经递质的水平,即降低DA及HVA的含量,提高5-HT及5-HIAA的含量,降低Glu/GABA的量,进而发挥改善睡眠的作用。