深圳湾红树林微生物多样性及其溶磷菌的筛选和应用研究

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红树林是生物多样性高度浓缩的海岸生态关键区域。由于土壤营养贫瘠,红树林生态系统的建设与维护问题至今仍处于瓶颈。深圳湾红树林位于亚热带海岸潮间带,其沉积物和海水的总磷含量较中国其他红树林湿地要低,说明该林地主要受限于磷,而对该生态系统微生物的溶磷能力及微生物对植物促生长作用的研究也是十分关键的。  本研究实验点位于深圳湾内湾北岸,根据岸段植被和周边环境情况自西向东设置了包括光摊、实验人工林地、十年人工林地及广东省福田红树林国家级自然保护区内林间地等四个调查样地。首先分析深圳湾红树林生态系统的各项环境指标,显示其pH集中在7.5-7.8之内,为弱碱性环境。其沉积物中总磷年均值为199.7mg/kg,海水中总磷年均值为0.55 mg/L。而沉积物中可供植物利用的溶解磷常年较少,仅占总磷的3.7%。作为湿地土壤的潜在磷源,能被微生物转化为生物有效磷的Ca-P为样地主要的无机磷形式之一,其含量约占总磷28%且比例较稳定。以16S rRNA gene为分子靶标,采用新一代高通量测序技术研究深圳湾红树林土壤的微生物多样性、群落结构、变化规律以及红树林植被与微生物之间的相互关系。在沉积物中占总群落比例1%以上的细菌分布在以下10个类群:酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、变形菌门和互养菌门。细菌群落中以厌氧绳菌目和芽孢杆菌目为主体,受温度和土层影响,其数量及多样性均高于古菌。龄期越长的植被,土壤中的微生物生物量越高、多样性越丰富。  从土壤微生物中对具有溶磷能力的细菌进行筛选,成功分离了29株无机磷溶磷菌,29株酸性植酸酶溶磷菌及28株中性植酸酶溶磷菌并测定了其溶磷能力,发现植酸酶溶磷菌的溶磷能力远高于无机磷溶磷菌,以SPC09及NSPC01溶磷量最高,为579.01 mg/L及512.78 mg/L,两种溶磷菌均鉴定为芽孢杆菌。所分离的57株植酸酶溶磷菌经16S rRNA比对分属于7科10属,其中34株为Bacillales目的成员。对溶磷能力最强的细菌SPC09的功能基因phytase进行基因克隆,并命名为Bc-phy。Bc-phy的开放阅读框长度为1005 bp,编码一个由334个氨基酸残基组成的多肽,其预算分子量为36.29kDa,等电点为5.59。此基因序列及其编码的氨基酸序列经BLAST比对后被认为是植酸酶超家族的成员,具有该家族所特有的保守功能域。BC-PHY与Gallaecimonas xiamenensis的3-植酸酶(WP_008482552.1)相似性最高,达70.0%。Alignment分析发现BC-PHY与均从海岸沉积物中分离所得的Gallaecimonasxiamenonsis,heinheimera sp.A13L,Ferrimonas balearica DSM9799以及Shewanella pivzotolerans WP3的植酸酶发生聚类。重组蛋白BC-PHY在原核系统中用pPrOEX-HTb载体表达并利用His-Tag进行纯化。纯化后的重组蛋白在体外检测到有溶磷活性,在60℃、pH6.5的条件下其溶解能力最强,证明所克隆的Bc-phy是与SPC09溶磷能力相关的功能基因。检测SPC09等九种分离所得溶磷菌的合成IAA、铁载体的能力及两两拮抗关系,并以不同的溶磷菌组合对盆栽秋茄进行接种实验。除单独接种SPC09和NSPC01能促进秋茄生长外,其他混合细菌组较商业化无机磷肥均取得更好的促进植物生长效果。  上述结果揭示了深圳湾红树林沉积物中蕴藏着丰富的微生物资源,通过功能细菌的筛选、应用及相关基因的克隆不但为新型微生物制剂的研发打下实验基础,亦为红树林重建及生态系统平衡的维持提供了重要的参考依据。
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