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炭疽杆菌的主要致病因子包括细菌荚膜和炭疽毒素，后者包含三种蛋白质成分：保护性抗原(protectiveantigen，PA)、致死因子(lethalfactor,LF)和水肿因子(edemafactor,EF)。PA通过与靶细胞结合将LF和EF导入细胞内发挥活性作用。PA与LF结合称为致死毒素(lethaltoxin，LT)，PA与EF结合称为水肿毒素(edematoxin，ET)。
PA能诱导机体的保护性免疫，是美国FDA批准的炭疽疫苗的主要免疫活性成分；EF具有钙调蛋白依耐的腺苷酸环化酶活性；LF具有金属依耐的蛋白酶活性。目前关于炭疽毒素作用的具体途径和分子机理还不清楚。治疗炭疽主要使用抗生素，但必须在感染初期立即使用，而在感染晚期由于患者体内毒素的大量产生，仍会导致患者死亡。因此，有必要发展针对炭疽毒素的治疗药物。
开展炭疽毒素作用机理研究和毒素抑制剂的筛选，需要获得大量的PA、LF和EF，而直接从炭疽杆菌的培养物中提取不仅产量低而且需要较高的生物安全防护设施，用基因工程的方法制备重组毒素可以克服上述缺点。
本研究首先将大肠杆菌外膜蛋白A(OmpA)的信号肽序列融合到PA基因的5’端，构建分泌型表达质粒，在大肠杆菌中实现了重组PA(rPA)的分泌型表达。重组蛋白位于细菌周质腔，表达量约占菌体总蛋白的10％。以离子交换、疏水层析和凝胶过滤为基础，建立了rPA的纯化工艺，每升培养物可获得约15mgrPA，HPLC纯度95％以上，N端15个氨基酸序列与天然PA完全一致。细胞模型试验显示rPA具有较好的生物学活性。
同样构建分泌型表达质粒，实现了重组LF(rLF)在大肠杆菌周质腔中的分泌表达。表达量约占菌体总蛋白的4％。经过离子交换和凝胶过滤纯化，每升诱导培养物可获得约3mg电泳纯的rLF。蛋白N端测序表明，rLF序列与天然炭疽LF一致。体外细胞模型试验亦显示rLF具有很好的生物活性。
利用pQE30表达载体，在大肠杆菌中表达出重组EF(rEF)。经鉴定，rEF以可溶形式表达于细菌胞质中。经过金属螯和、阳离子交换和凝胶层析，每升诱导培养物可获得约5mg重组蛋白。体外细胞试验显示rEF具有很好的生物活性。在两种细胞模型试验中，rEF能和LF共同竞争与PA的结合位点，二者相互抑制。
在获得具有生物活性的重组毒素的基础上，开展了毒素抑制剂的探索研究。首先以rPA为免疫原，常规免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，筛选能特异分泌抗PA单抗的杂交瘤细胞克隆，用细胞毒中和试验检测单抗对炭疽致死毒素的中和作用，获得了3株具有毒素中和活性的单抗，它们分别识别2个不同的PA抗原表位。
从Hela细胞中克隆出炭疽毒素受体ATR(CMG2)基因，构建表达质粒，实现了重组ATR(CMG2)胞外区(rATR(CMG2)-EXCELL)在毕赤酵母中的分泌表达。表达量约占培养物上清总蛋白的20％。纯化后的rATR(CMG2)-EXCELL具有PA结合活性，并在细胞模型实验中可保护细胞不受炭疽致死毒素作用。
构建表达质粒，在PA受体结合区(PA-D4)基因片段的5’端融合了OmpA的信号肽序列，在大肠杆菌中实现了PA-D4的可溶分泌型表达。重组PA-D4以可溶形式表达，表达量约占菌体总蛋白的10％。经过离子交换层析和凝胶过滤纯化，每升诱导培养物可获得约10mgPA-D4。蛋白N端测序表明PA-D4序列与天然序列一致。免疫印迹试验显示PA-D4可与抗PA血清结合。
本研究建立了三种重组炭疽毒素蛋白的表达和纯化方法，以及相关的细胞模型和活性检测方法，并从中和性单抗、受体胞外区和PA受体结合区的角度对毒素抑制剂进行了探索研究。这些工作将有助于进一步研究炭疽毒素的作用机理，发展炭疽防治药物和新型疫苗。