【摘 要】
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病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是最近几年来较为盛行的一种运用植物病毒载体来抑制植物宿主内源基因表达的有效手段。病毒通过改造后携带了一段和植物
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病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是最近几年来较为盛行的一种运用植物病毒载体来抑制植物宿主内源基因表达的有效手段。病毒通过改造后携带了一段和植物同源的基因，进而通过侵染诱导植物沉默内源基因。宿主VI GS作为一项有效的研究植物基因功能的实验方法，具有操作简单、周期短、效率高、成本低廉等特点。狗尾草花叶病毒（Foxtail mosaic virus,FoMV）是马铃薯X病毒属（Potexvirus）的成员，单链正义RNA，有着非常广泛的宿主范围，可侵染包括水稻、大麦、高粱等56种禾本科植物和35种双子叶植物。国内外对于利用FoMV改造成病毒VIGS载体还没有相关的报道。 本研究以pCB301-FoMV载体为母体，设计了2种病毒载体构建策略：1、通过破坏5A的ORF框，使其不表达，同时在其中插入多克隆位点，构建载体pCB301-FoMV-Vector-MCS，2、在野生型FoMV的CP终止密码子之后插入多克隆位点，构建载体pCB301-FoMV-CP-MCS。在以上两个病毒载体的基础上，以重复外壳蛋白亚基因组启动子的方式，利用该病毒载体表达绿色荧光蛋白（GFP）。本实验选取了与FoMV同属的马铃薯X病毒（PVX）的CP亚基因组启动子，完成对pC B301-FoMV-Vector-PVX-GFP和pCB301-FoMV-CP-PVX-GFP的构建，结果表明，pCB301-FoMV-Vector-PVX-GFP浸润接种的本氏烟在接种叶和系统叶都无绿色荧光，并且在系统叶叶也检测不到病毒，pCB301-FoMV-Vector-PVX-GFP没有侵染活性，其原因可能是，虽5A蛋白对于病毒的复制不重要，但5A蛋白的碱基序列对于指引CP的正确表达起作用。载体pCB301-FoMV-CP-PVX-GFP，在接种叶能发出绿色荧光，但是荧光仅限制在接种区域，系统叶并没有出现绿色荧光，经RT-PCR分析，在系统叶却能检测到病毒，但所扩增出的条带和预期大小不符，出现了和野生型病毒相同的条带。 在载体pCB301-FoMV-CP-MCS的基础上，我们反向插入了本氏烟的Su片段和大麦的PDS片段，获得pCB301-FoMV-CP-NbSu和pCB301-FoMV-CP-HvPDS克隆。pCB301-FoMV-CP-NbSu接种结果表明，在本氏烟中成功诱导了本氏烟对自身Su基因的沉默，出现了黄斑现象。在单子叶植物大麦（Hordeum v ulgare）中，我们先将携带有大麦PDS片段的病毒载体pCB301-FoMV-CP-HvPDS先在RdR6本氏烟中扩繁，然后通过汁液摩擦的方式将病毒转接至大麦中，同样诱导了大麦出现了漂白的现象。RT-PCR结果表明，不论是在本氏烟还是在大麦中，外源基因都能随病毒的复制稳定的遗传，不会出现片段丢失的现象，能够持久的在植物中诱导对宿主基因的沉默。
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