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目的 卵巢玻璃化冻存移植是青年癌症患者保存生育力的重要方法,但移植过程中的缺血缺氧损伤易造成移植后卵泡丢失和凋亡,影响了卵子的存活及质量。课题组前期的研究结果显示,在卵巢玻璃化冻存过程中添加0.3 IU/mL FSH(Follicle-stimulating hormone,卵泡刺激素)可以减轻卵泡凋亡,这一作用可能通过调控ERS途径实现。颗粒细胞在卵泡成熟过程中起着重要的作用,颗粒细胞和卵母细胞之间的对话和相互作用可能是卵泡启动生长的原因。CX43是颗粒细胞间重要的缝隙连接蛋白,直接维系颗粒细胞间、颗粒细胞与卵母细胞间营养供给和信号表达。项目组前期研究提示,FSH可以通过提高缝隙连接蛋白CX43的表达促进卵泡存活,起到抗凋亡的作用,但具体机制不详。本研究拟以21日龄TM(tunicamycin,衣霉素)诱导的大鼠卵巢颗粒细胞为模型,探讨FSH是否通过调控内质网应激途径抑制卵巢颗粒细胞的凋亡,并通过RNA干扰技术下调缝隙连接蛋白CX43的表达,探讨内质网应激介导的卵巢颗粒细胞凋亡的机制,从而为进一步揭示FSH在卵巢玻璃化冻存过程中的抗凋亡作用机制提供科学依据。方法 21日龄SD大鼠超数排卵,体外分离并培养卵巢颗粒细胞,通过形态学观察及颗粒细胞特异性标志分子FSHR的细胞免疫荧光进行鉴定;应用内质网应激诱导剂衣霉素(tunicamycin,TM)诱导颗粒细胞内质网应激模型,并筛选最佳的TM作用浓度;应用FSH及内质网应激特异性抑制剂TUDCA抑制TM诱导的内质网应激信号介导的颗粒细胞凋亡,应用流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR及western blot方法检测颗粒细胞相关基因及蛋白表达,揭示FSH是否抑制了内质网应激介导的凋亡信号通路,进而减少卵巢颗粒细胞的凋亡;应用RNA干扰技术下调FSH特异性调节基因CX43,应用实时荧光定量PCR及western blot方法检测颗粒细胞CX43基因及蛋白表达,流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率,应用免疫荧光技术检测并定位内质网应激促凋亡蛋白caspase-12、CHOP和p-JNK,凋亡标志蛋白cleaved caspase-3,揭示CX43下调引起的颗粒细胞凋亡是否通过激活内质网应激途径的凋亡信号。结果 (1)通过检测细胞增殖曲线及内质网应激相关分子确定了TM的最佳干预浓度为10μg/mL;FSH的最佳干预浓度为:0.3 IU/mL;TUDCA的干预浓度为:0.5 mg/mL。(2)流式细胞术结果显示FSH可以使TM诱导的ERS介导的卵巢颗粒细胞凋亡率降低。对GRP78蛋白表达分析结果提示FSH处理组颗粒细胞的GRP78表达显著低于TM组的表达(p<0.01);对CHOP蛋白定量分析结果提示FSH处理组颗粒细胞的CHOP表达非常显著地低于TM组的表达(p<0.001);对ATF6的蛋白定量分析结果提示FSH处理组颗粒细胞的ATF6表达高于TM组的表达(p<0.05)。说明FSH对TM诱导的ERS介导的卵巢颗粒细胞凋亡有保护作用,这种作用可能通过诱导ERS走向UPR保护通路而实现。(3)慢病毒干扰卵巢颗粒细胞后,实时荧光定量PCR、western blot及流式细胞术结果揭示CX43基因及蛋白水平显著下调,并导致了卵巢颗粒细胞的凋亡增加;(4)下调卵巢颗粒细胞CX43表达后,颗粒细胞核发生凝聚、固缩,内质网应激促凋亡蛋白caspase-12、CHOP和p-JNK表达定位发生了核转移;与caspase-12、CHOP和p-JNK定位结果一致,凋亡标志蛋白cleaved caspase-3也位于凋亡的卵巢颗粒细胞核,说明内质网应激通路参与了颗粒细胞的凋亡。结论:(1)FSH可抑制内质网应激诱导的卵巢颗粒细胞凋亡;(2)FSH可能通过调节CX43进而抑制内质网应激介导的颗粒细胞的细胞凋亡信号。