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SABATHMT基因依赖于S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L- methionine,SAM)提供的甲基供体合成小分子甲酯类物质(如水杨酸甲酯,苯甲酸甲酯,肉桂酸甲酯和茉莉酸甲酯等,常为植物的特征挥发性香气物质)和一些生物碱(如可可碱和咖啡因)。其中苯甲酸甲酯是白姜花主要特征香气成分之一。本试验对白姜花花瓣中SABATHMT基因进行了克隆和表达分析,探索该基因的表达与花香味的关系,对了解白姜花花香的形成机制和培育新品种具有重要的指导作用,同时也为该基因家族的进化研究提供理论依据和试验参考。
本试验采用RT-PCR、RACE与TAIL-PCR相结合的方法对白姜花的SABATHMT基因进行克隆并进行了半定量表达研究,Southern杂交及原核表达分析,主要研究结果如下:
1.采用RT-PCR、RACE与TAIL-PCR相结合的方法,首次从白姜花花瓣中克隆到SABATHMT基因cDNA全长序列,并命名为HCMT。序列分析表明,该基因cDNA全长核苷酸序列长度为l145bp,读码框为l128bp,其推导的氨基酸序列含有376个氨基酸。
2.以actin作为内参,分别以白姜花不同开花时期、不同器官部位和不同种类品种姜花为模板进行半定量分析,研究发现HCMT在花蕾期和全凋期表达很弱,盛开期及半凋期表达量最强;HCMT主要在花瓣,雄蕊,花萼和茎中表达,在叶片和苞片中不表达;在白姜花和泰国姜花×粉姜花表达量高,而在金姜花和金姜花×红姜花表达量低。
3.对姜花花瓣分别进行不同浓度茉莉酸甲酯和水杨酸、IAA、伤诱导、低温、暗处理、干旱处理,茉莉酸甲酯、水杨酸及IAA对其表达有抑制作用,而伤诱导、低温、暗处理、干旱处理对HCMT的表达有一定的促进作用。
4.根据已知序列设计探针引物,对白姜花总DNA基因组分别用XhoI、kpnI,EcoRI、EcoRV、XbaI进行酶切,与制备好的探针进行Southern杂交,证实克隆到的HCMT为多拷贝基因。
5.成功构建HCMT正义表达载体。
6.成功克隆姜花HCMT的基础上,构建重组原核表达载体,IPTG诱导表达,重组蛋白采用镍螫合层析柱纯化得到目的蛋白。