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原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是临床常见的消化道恶性肿瘤,发病率居恶性肿瘤第5位,死亡率位居第3位。除了外科手术,肝癌患者还依赖全身化疗、介入及局部放疗,控制疾病进程及提高5年生存率。该病高死亡率与肝癌细胞高度侵袭和高度转移的生物学特征密切相关。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在某些特殊的生理或病理条件下失去极性,转变为能在细胞基质自由移动、具有迁移能力的间质细胞。研究表明,EMT是包括肝癌在内的多种上皮细胞来源的恶性肿瘤发生侵袭转移的生物学基础。大多数实体肿瘤常常表现为局部缺氧状态。缺氧微环境是肿瘤细胞对化疗、放疗产生耐受性的重要原因,也是促进多种肿瘤发生早期侵袭转移的重要因素。在缺氧微环境下,缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)被激活,与下游靶基因启动子区域的缺氧反应元件结合,参与转移级联反应,发挥促进肿瘤增殖、发生EMT、诱导新生血管形成等功能。因此,开发能够抑制肿瘤缺氧微环境相关因子的抗肿瘤药物,对改善肝癌患者的预后具有重要的意义。中草药南蛇藤(Celastrusorbiculatus Thunb.)为卫矛科南蛇藤属落叶木质藤本植物,在我国已有几千年的应用历史,具有散血通经、强筋骨、祛风湿以及消炎解毒的功效。课题组前期体内外实验研究发现,南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(C.orbiculatus ethyl acetate extract,COE)对肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、凋亡及血管生成等方面具有显著的抑制作用,但其对缺氧微环境下肿瘤细胞的作用尚不清楚。本课题首先利用CoCl2化学诱导法,建立人肝癌HepG2细胞稳定的缺氧微环境。以不同浓度的COE干预,研究缺氧微环境下,药物对人肝癌HepG2细胞EMT的影响及其作用机制。本课题的研究,可为研发新型抗肝癌药物提供充分的理论依据。本课题共分为三部分研究内容。第一部分缺氧微环境对人肝癌HepG2细胞上皮间质转化的影响目的:CoCl2化学诱导法建立人肝癌HepG2细胞稳定的缺氧微环境。观察缺氧微环境对人肝癌HepG2细胞发生EMT的影响。方法:对数期人肝癌HepG2细胞,以不同浓度(50,100,200,400,800 μmol/L)的CoCl2诱导24 h,MTT法检测CoCl2对人肝癌HepG2细胞增殖的影响,确定建立稳定的缺氧微环境细胞模型时CoCl2的浓度。100 μmol/L的CoCl2作用于人肝癌HepG2细胞24 h后,观察细胞的形态变化,并分别以Westernblot和细胞免疫荧光法检测HIF-1α及EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表达情况。结果:不同浓度(50,100,200,400,800 μmol/L)的CoCl2作用人肝癌HepG2细胞24h后,细胞生长受到不同程度的抑制。当CoCl2浓度≤100μmol/L时,对细胞增殖无显著影响(P>0.05)。根据CoCl2对人肝癌HepG2细胞的抑制率,计算CoCl2的半数抑制浓度为(half maximal inhibitory concentration,IC50)为 468.4μmol/L,并确定后续实验 CoCl2的诱导浓度为100 μmol/L。100 μmol/L浓度的CoCl2诱导HepG2细胞24 h后,与野生型细胞相比,细胞形态发生纺锤样改变。Westernblot和细胞免疫荧光实验均表明,细胞E-cadherin蛋白的表达水平下降(P<0.01);HIF-1α,N-cadherin 和 Vimentin 的蛋白表达水平上升(P<0.01)。结论:100 μmol/L的CoCl2诱导人肝癌HepG2细胞24 h,成功建立稳定的缺氧微环境。缺氧微环境下,人肝癌HepG2细胞更易发生上皮间质转化。第二部分南蛇藤提取物对缺氧微环境下人肝癌HepG2细胞的影响目的:研究缺氧微环境下,不同浓度的南蛇藤提取物(COE)对人肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移及EMT的影响。方法:对数期人肝癌HepG2细胞,经100 μmol/L的CoCl2诱导后,加入不同浓度(80,160,240,320,400 μg/mL)的COE,作用24h,MTT法检测各药物浓度对HepG2细胞增殖能力的影响,计算IC50,确定后续实验的COE作用浓度。不同浓度(160,200,240 μg/mL)的COE及阳性对照药物顺铂(DDP,2μg/mL),作用于缺氧微环境下的HepG2细胞24h后,流式细胞术检测细胞凋亡情况;线粒体膜电位(JC-1)检测细胞凋亡途径;细胞划痕实验检测细胞伤口愈合能力;Transwell小室实验检测细胞侵袭转移能力的改变;Western blot和细胞免疫荧光法检测EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表达情况。结果:不同浓度(80,160,240,320,400μg/mL)的COE,作用缺氧微环境下的HepG2细胞24 h后,细胞的增殖被抑制,并呈一定的时间及浓度依赖性;根据COE对人肝癌HepG2细胞的抑制率,计算出COE作用24 h,对人肝癌HepG2细胞的IC50为316.5μg/mL。当COE浓度<80μg/mL时,对细胞的增殖无影响(P>0.05)。不同浓度(160,200,240 μg/mL)的COE,作用HepG2细胞24h后,随着COE浓度的增加,细胞晚期凋亡率逐渐增加,线粒体膜电位逐渐降低;细胞的伤口愈合、侵袭和转移能力逐渐降低。Westemblot和细胞免疫荧光检测结果表明,细胞E-cadherin蛋白的表达量逐渐增多(P<0.01),N-cadherin和Vimentin的蛋白表达量逐渐降低(P<0.01)。结论:COE抑制了缺氧微环境下人肝癌HepG2细胞的增殖;COE通过线粒体途径促进了 HepG2细胞的凋亡;COE能够不同程度的抑制HepG2细胞侵袭和转移及EMT的发生。第三部分南蛇藤提取物抑制缺氧微环境下人肝癌HeG2细胞上皮间质转化的分子机制目的:探讨缺氧微环境下,南蛇藤提取物(COE)抑制人肝癌HepG2细胞上皮间质转化的作用机制。方法:对数期人肝癌HepG2细胞,经100μmol/L的CoCl2诱导后,加入不同浓度(160,200,240 μg/mL)的 COE 作用 24 h,Western blot 检测细胞中 HIF-1α/Twist1 信号通路相关蛋白表达水平的变化。加入HIF-1α蛋白抑制剂YC-1后,Transwell小室实验检测COE(200 μg/mL)对HepG2细胞侵袭、转移能力的影响。Westernblot及细胞免疫荧光实验,检测HepG2细胞EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)及HIF-1α/Twist1信号通路相关蛋白的表达水平。结果:缺氧微环境下,不同浓度(160,200,240 μg/mL)的COE作用24h后,HIF-1α、Twist1蛋白的表达量降低,呈浓度依赖性(P<0.05)。与对照组相比,YC-1组的细胞侵袭迁移能力下降(P<0.01);E-cadherin蛋白的表达量增加(P<0.05),HIF-1α、Twist1、Vimentin 和 N-cadherin 蛋白的表达量降低(P<0.01)。同时,与对照组相比,COE(200μg/mL)联合YC-1组,抑制细胞侵袭迁移的能力最强(P<0.01),E-cadherin 蛋白的表达量最高(P<0.01),HIF-1α、Twist1、Vimentin 和N-cadherin蛋白的表达量最低(P<0.01)。结论:缺氧微环境下,COE抑制人肝癌HepG2细胞的EMT过程,其分子机制可能与HIF-1α/Twist1信号通路相关。