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生物钟基因是设定并调控机体出现昼夜节律周期的系统,是一种以近似24小时为周期的振荡器。hCLOCK基因处于生物钟基因家族的中心,其表达及功能的改变,导致机体生物节律失调,从而促进肿瘤发生发展。结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,尽管在手术切除、化疗以及放疗方面都取得了不小进展,但结直肠癌死亡率仍居高不下,寻找更多新的影响结直肠癌发生发展的关键基因或特异的分子标志物,研究其功能,对结直肠癌的诊断、预后监测以及新的抗肿瘤药物的研制都具有重要意义。本研究将分为四部分,就hCLOCK基因在结直肠癌中的表达及其促进肿瘤进展的作用与机制进行体内外系统研究,以期为以hCLOCK基因成为新的靶点治疗结直肠肿瘤提供理论依据。第一部分hCLOCK基因及部分其下游调控基因在人结直肠癌中的表达目的1.分析hCLOCK基因在人结直肠癌及配对正常肠道粘膜组织中表达的差异,及其与病理、临床资料的关系；2.检测hCLOCK下游调控基因,包括(1)生物钟基因hPER2;(2)肿瘤血管新生相关基因(HIF-1α、ARNT、VEGF);及(3)细胞凋亡相关基因(BAK、BAX、 BID、TNFR I、TNFR II)在结直肠肿瘤中的表达,并分析与hCLOCK表达改变的相关性。方法1.免疫组化方法检测hCLOCK蛋白及hPER2蛋白在癌组织与配对正常组织中的表达；2.荧光定量实时PCR方法检测hCLOCK基因及部分其下游调控基因(HIF-1a、ARNT、VEGF、BAK、BAX、BID、TNFR I、TNFR I)在癌组织与配对正常组织中mRNA水平表达的差异。结果1.在结直肠癌及癌旁正常肠道粘膜中hCLOCK、hPER2均有表达；hCLOCK蛋白在结直肠癌中表达增高,而hPER2蛋白在结直肠癌中表达下调(P<0.01)；2. hCLOCK蛋白在结直肠癌中表达上调与患者肿瘤有无发生淋巴结转移、及TNM分期有显著相关性。在发生淋巴、血运转移的患者中,hCLOCK在肿瘤灶中的表达增高(P<0.05)；3. hCLOCK在肿瘤灶中表达增高与hPER2的表达下调相关(P<0.05)；患者年龄愈小,结直肠癌组织分化程度愈低,浸润深度愈深,已发生淋巴结转移、TNM分期愈晚,hPER2基因蛋白表达率也愈低(P<0.05)；4.与配对正常肠道粘膜组织相比,在人结直肠癌组织中,hCLOCK基因mRNA表达水平明显增高(P<0.01),而hPER2mRNA表达水平无明显差异；5. hCLOCK在肿瘤中的表达与肿瘤血管新生相关基因ARNT、HIF-1α及VEGF表达水平呈线性正相关(P<0.05),而与BAK、BAX、BID、TNFRI及TNFR Ⅱ等凋亡通路相关基因表达尚未见明显相关性。结论1.生物钟基因hCLOCK在人结直肠癌中表达水平升高,并且与肿瘤进展、淋巴结、血运转移相关；2.生物钟基因hPER2蛋白在结直肠癌中表达下调,并且与患者年龄、肿瘤组织学分级、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期都有一定相关性；3. hCLOCK在肿瘤灶中表达增高与hPER2的表达下调相关；4. hCLOCK在结直肠癌中的表达与肿瘤血管新生相关基因ARNT、HIF-1α及VEGF表达水平呈线性正相关。第二部分结直肠癌细胞株中hCLOCK基因的表达目的1.检测hCLOCK基因在四株人结直肠癌细胞株HT29、LoVo、SW480、SW620中的表达情况；分析hCLOCK的表达与不同肿瘤细胞株细胞运动、侵袭、转移能力的关系；2.筛选出hCLOCK基因表达水平较高及较低的结直肠癌细胞株各一株,进行后续hCLOCK功能研究。方法1. Western Blot法检测蛋白表达；2.荧光定量实时PCR方法检测基因mRNA表达。结果1. hCLOCK在高转移性结直肠癌细胞株SW620中mRNA及蛋白表达均最高；2. hCLOCK在低转移性结直肠癌细胞株SW480中表达水平较低。结论1. hCLOCK基因的高表达与肿瘤细胞恶性程度高,转移性强相关；2.选取SW620细胞株作为hCLOCK的高表达本体,SW480细胞株作为hCLOCK的低表达本体,进行后续hCLOCK功能研究。第三部分过表达及干扰hCLOCK表达慢病毒载体的构建和包装目的1.构建并包装带有特定hCLOCK基因序列的慢病毒颗粒,以稳定表达目的基因hCLOCK；2.构建并包装带有特定hCLOCK RNAi干扰靶点的慢病毒颗粒,以稳定沉默目的基因hCLOCK的表达。方法1.构建慢病毒载体重组质粒；2.慢病毒包装。结果1.成功制备高表达hCLOCK基因的慢病毒浓缩液hCLOCK/GV186；2.成功制备干扰hCLOCK表达的慢病毒浓缩液hCLOCK/GV113-RNAi。第四部分hCLOCK促进结直肠癌细胞增殖及侵袭转移的作用与机制研究目的1.制备高表达hCLOCK的结直肠癌细胞SW480-hCLOCK,以感染空载体病毒的SW480-Vec作为对照组；2.制备干扰hCLOCK表达的结直肠癌细胞SW62O-shhCLOCK;并以感染空载体病毒的SW620-Vec作为对照组；3.研究hCLOCK的表达对结直肠肿瘤细胞增殖、凋亡、转移等细胞生物学活性的影响；4.检测实验组及对照组中肿瘤血管新生相关基因(VEGF、ARNT、HIF-1α)、凋亡相关基因(AKT、P-AKT、BID、BAX)的蛋白表达情况,以期进一步明确hCLOCK是否可能通过影响肿瘤血管新生及细胞凋亡通路,从而促进结直肠肿瘤进展、转移的分子机制。方法1.将高表达hCLOCK基因的慢病毒浓缩液hCLOCK/GV186感染SW480细胞；通过荧光检测及Western Blot检测验证SW480-hCLOCK中hCLOCK的表达较感染空载体病毒的SW480-Vec组明显增高；2.将干扰hCLOCK表达的慢病毒浓缩液hCLOCK/GV113-RNAi感染SW620细胞；通过荧光检测及Western Blot检测验证SW620-shhCLOCK中hCLOCK的表达较感染空载体病毒的SW620-Vec组明显降低；3.MTT实验、流式细胞术、Transwell实验分别检测细胞的增殖、凋亡、侵袭情况；4. Western Blot技术检测实验组及对照组中肿瘤血管新生相关基因(VEGF、 ARNT、HIF-1α、凋亡相关基因(AKT、P-AKT、BID、BAX)的蛋白表达情况。结果1. SW480-hCLOCK较SW480-Vec细胞增殖加快；SW620-shhCLOCK较SW620-Vec细胞增殖减慢(P<0.01)；2. SW480-hCLOCK较SW480-Vec细胞凋亡减少；SW620-shhCLOCK较SW620-Vec细胞凋亡增多(P<0.05)：3. SW480-hCLOCK较SW480-Vec穿过聚碳酸酯膜细胞数明显增多；SW620-shhCLOCK较SW620-Vec穿过聚碳酸酯膜细胞数明显减少(P<0.01)；4. VEGF、HIF-1α、ARNT蛋白表达在SW480-hCLOCK较SW480-Vec中明显增高(P<0.01)；在SW620-shhCLOCK较SW620-Vec中降低(P<0.01)；5.促凋亡基因BAX、BID蛋白表达在SW480-hCLOCK较SW480-Vec中降低(P<0.05)；而抗凋亡因子P-AKT蛋白在SW480-hCLOCK较SW480-Vec中表达增高,在SW620-shhCLOCK较SW620-Vec中表达降低(P<0.01)。结论1. hCLOCK抑制结直肠肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖、浸润及转移；2. hCLOCK通过促进结直肠肿瘤中VEGF、HIF-1α、ARNT等基因的表达及功能活性,从而促进肿瘤中微血管新生,作用于结直肠肿瘤的浸润、侵袭及转移等进展过程；3. hCLOCK通过促进抗凋亡基因P-AKT的表达及活性,同时抑制促凋亡基因BAX及BID的表达及活性,从而抑制肿瘤细胞的凋亡过程。