【摘 要】
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黄沙鳖是广西地区重要的水产养殖品种。近几年,黄沙鳖的密集养殖导致了致病菌大量滋生,给黄沙鳖养殖业带来巨大的损失。同时,养殖户对抗生素的不合理使用,使致病菌耐药性加剧。抗菌肽（Antimicrobial peptide,AMPs）是生物体免疫系统中由多种生物组织及细胞产生的一类防御外来病原的小分子活性多肽,在新型抗菌药物开发上具有重大的研究价值。因此,黄沙鳖抗菌肽的相关研究有望为新型抗菌药物的开发提
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黄沙鳖是广西地区重要的水产养殖品种。近几年,黄沙鳖的密集养殖导致了致病菌大量滋生,给黄沙鳖养殖业带来巨大的损失。同时,养殖户对抗生素的不合理使用,使致病菌耐药性加剧。抗菌肽（Antimicrobial peptide,AMPs）是生物体免疫系统中由多种生物组织及细胞产生的一类防御外来病原的小分子活性多肽,在新型抗菌药物开发上具有重大的研究价值。因此,黄沙鳖抗菌肽的相关研究有望为新型抗菌药物的开发提供基础数据、对黄沙鳖病害防控有着重要意义。本实验对黄沙鳖抗菌肽cathelicidin基因进行克隆,并分析其m RNA组织分布特征以及在细菌攻毒后不同时间点在心脏、肝脏、脾脏、肾脏的表达变化;构建黄沙鳖cathelicidin成熟肽的重组表达载体,使用IPTG诱导并进行表达,并用SDS-PAGE和Western blotting方法检验表达情况;检测化学合成的黄沙鳖cathelicidin成熟肽的生物学活性,为研究cathelicidin在黄沙鳖先天免疫中的潜在作用提供基础数据。主要结果如下:1、本试验采用RACE技术对黄沙鳖抗菌肽cathelicidin基因进行克隆,得到黄沙鳖cathelicidin基因全长c DNA序列1026 bp,包括开放阅读框序列483 bp、5’非编码区315 bp和3’非编码区228 bp。其中开放阅读框预测编码160个氨基酸,其氨基酸序列具有4个保守的半胱氨酸残基。生物信息学分析结果表明黄沙鳖cathelicidin基因推导氨基酸序列（Gen Bank登录号:MK250818）与中华鳖cathelicidin基因序列相似性最高,为97.5%。经比对发现,本实验的黄沙鳖cathelicidin基因的氨基酸序列包括信号肽区域、保守的cathelin区和羧基端成熟肽区域。2、通过荧光定量PCR技术检测黄沙鳖cathelicidin基因在不同组织中的表达特征,以及cathelicidin m RNA在细菌攻毒后不同时间点的表达变化。结果表明,cathelicidin基因在健康黄沙鳖的脾脏和肝脏中表达量相对较高,其次是心脏。当温和气单胞菌感染黄沙鳖后,黄沙鳖心脏cathelicidin基因m RNA表达量呈先升后降的趋势,在第24 h、36 h和48 h时,心脏cathelicidin基因m RNA相对表达量分别是对照组的4.1倍、17.0倍和3.9倍;黄沙鳖肝脏cathelicidin基因m RNA表达量亦呈先升后降的趋势,在第3 h和6 h其相对表达量分别为对照的28.2倍和3.6倍;黄沙鳖脾脏cathelicidin基因m RNA表达量呈升、降、升、降的趋势,在第3 h和36 h,其相对表达量为对照的23.1倍和3.5倍;黄沙鳖肾脏cathelicidin基因m RNA表达量呈先升后降的趋势,在第3 h和6 h,其相对表达量为对照的2.3倍和17.5倍。3、成功构建黄沙鳖cathelicidin成熟肽的重组质粒pET-His-Hs-CATH。经IPTG诱导和SDS-PAGE验证,重组表达产物与推测的理论产物大小6.5k Da相符。经Western blotting鉴定,Hs-CATH重组蛋白能与anti-6×His tag抗体发生特异反应,说明Hs-CATH重组蛋白在原核表达系统中的成功表达。4、通过化学方法合成黄沙鳖cathelicidin成熟肽蛋白Hs-CATH并对其进行生物学活性研究。Hs-CATH对海豚链球菌FCL1和无乳链球菌YZB1的MIC依次为3.13μg/m L和6.25μg/m L;对松鼠葡萄球菌HCH1、类志贺邻单胞菌YZH1、蜡样芽孢杆菌YLL1和大肠杆菌ATCC 25922的MIC均为12.5μg/m L,表明化学合成的Hs-CATH具有一定的抗菌活性。浓度为40μg/m L、80μg/m L、160μg/m L、320μg/m L的Hs-CATH对DPPH自由基的清除率依次为7.1%、16.2%、27.5%、41.8%,即随着浓度的增加,Hs-CATH的抗氧化能力逐渐增强。浓度为20μg/m L、40μg/m L、80μg/m L、160μg/m L的Hs-CATH对新鲜黄沙鳖血红细胞的溶血率依次为0.2%、1.6%、3.9%、4.8%。可见浓度为20μg/m L至160μg/m L的Hs-CATH多肽样品的溶血活性处于较低水平。
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