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本研究主要通过筛选对水牛CD14基因有抑制作用的shRNA片段,利用慢病毒载体介导的RNA干扰技术,体外研究其对水牛外周血单核巨噬细胞CD14基因的抑制效果及在LPS刺激下对相关基因表达的影响,以便为进一步研究CD14基因在布菌所致炎症反应中的作用,寻求家畜布病防治新方法奠定基础。1.设计5条水牛CD14shRNA(319/421/755/970/1041)及1条阴性对照序列(NC-1864),构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP-shRNA。利用脂质体法将其分别与融合表达载体pDsRed-N1-buffalo CD14共转染HEK293细胞,72h后进行QRT-PCR和FACS检测,筛选具有抑制效果的shRNA片段。结果显示：与对照组相比,各干扰组中外源水牛CD14基因在mRNA和蛋白水平上的表达均有不同程度的降低,其中CD14shRNA-1041靶点的抑制效率最高(P<0.01)。2.采用磷酸钙沉淀法将筛选出来的有效CD14shRNA及无关序列NC-1864的慢病毒重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞,进行慢病毒包装和滴度测定；以慢病毒颗粒感染体外分离培养的水牛外周血单核巨噬细胞,7d后采用1ug/mL LPS刺激细胞3h,QRT-PCR检测各组细胞中CD14、TLR4、IL-6和TNF-α基因在mRNA水平上的表达。结果显示：具有最高抑制效果的CD14shRNA-1041有效降低了内源性CD14基因的表达；与对照组相比,LPS刺激后,感染慢病毒的细胞CD14mRNA表达明显受到抑制,TLR4、IL-6和TNF-α基因(?)mRNA表达水平也显著降低。上述结果表明,筛选获得的水牛CD14基因319、421、755、970和(?)41五个shRNA序列位点均能有效抑制CD14基因的表达,其中1041位点的干扰效率最高；CD14shRNA-1041慢病毒颗粒不仅可以成功抑制水牛外周血单核巨噬细胞CD14mRNA的表达,还可以有效抑制LPS刺激下CD14、TLR4、IL-6和TNF-α基因的表达,降低TLR4对LPS的信号传导效能。