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研究背景及目的:
锰(manganese,Mn)作为机体所必需的微量元素,在生物体内众多反应中发挥重要作用,同时也是职业危害因素和环境污染物之一。机体缺乏Mn的发生率很小,然而暴露于高Mn环境却是很常见的。随着科技的发展,Mn在各行各业,如石油化工业、采矿业、钢铁业、农业、医疗业等中的应用日益广泛,使得各行业的人群,如交通警察、炼油厂工人、加油站职工、电焊工人和繁华马路附近居民等等接触Mn的机会增加。因此,长期低水平Mn暴露对人体健康的影响值得深入探讨。
已有报道Mn暴露后,过多的Mn进入生物体内,由肝脏代谢,主要蓄积在肝脏和大脑内。在肝脏内蓄积,使肝脏线粒体DNA损伤,减低GSH水平,也能使肝脏胆汁代谢异常,导致肝脏损伤；在大脑内蓄积,导致帕金森氏综合症。最近研究发现,Mn对神经系统的毒性作用随着作用时间的增长而加剧,其中很多生化指标在停止染毒一段时间后仍持续改变。职业性Mn接触的工人在停止Mn接触后依然有记忆力减退、平衡力下降、肌力下降等神经系统的症状。但目前关于Mn对肝脏毒性的时间-效应关系研究甚少,且这些报道多在对肝脏病理改变和肝脏的生化指标上的研究,Mn造成肝脏毒性的机制的研究较少。对于过多的Mn在体内是如何导致肝脏细胞、各亚细胞结构损伤的机理尚不清楚；对于停止锰接触并给予一定恢复时间后,肝脏损伤的发展趋势并不清楚。
本课题围绕锰接触后肝脏损害的可能的机制进行研究,建立低剂量Mn亚急性及亚慢性暴露的动物模型,并测定肝脏及亚细胞器功能、抗氧化的指标,以及病理损伤情况,进一步探索其毒性机制。为锰的肝脏毒性评价及其防治提供更多的资料,为治疗锰中毒的肝损伤的患者提供参考依据,为国家有关部门制定锰的管理和控制措施提供参考依据。
研究内容:
1.用剂量为6mg(Mn)/kg(BW)·d 氯化锰腹腔注射染毒,建立大鼠亚急性锰中毒(染毒Ⅰ组,30d)、亚慢性锰中毒(染毒Ⅱ组,90d)和亚慢性锰中毒后给予一定恢复期(染毒Ⅲ组,90d+恢复期30d)的动物模型。
2.观察肝脏大体形态,光镜、电镜下病理学变化。
3.分别测定血液学、血液生化学指标,肝体比,肝脏组织中Mn、Mg、Ca、Fe、Cu、Zn元素含量,肝脏匀浆中MDA含量、GSH含量、GSH-Px活力、T-AOC。
4.测定血清中8-OHdG的含量,探讨Mn与细胞核氧化损伤的关系。
5.测定肝亚细胞器(细胞膜,细胞核和线粒体)中MDA含量、GSH含量、GSH-Px活力和细胞膜、线粒体中Na+K+-ATP酶、Ca2+Mg2+-ATP酶、Cu2+-ATP酶活性以及线粒体中SDH酶的活性。
结果:
与相应对照组相比
1.肝脏大体情况:染毒Ⅰ、Ⅱ组肝脏与周围组织粘连,有不同程度的充血水肿、边缘钝、颜色泛黄,局部带片状区域颜色呈灰紫色改变；染毒Ⅲ组肝脏与周围组织粘连,表面较染毒Ⅱ组光滑,充血水肿减轻,边缘稍钝,颜色红润,可见局部带状区域颜色恢复痕迹。
2.肝脏病理组织学情况:染毒Ⅰ、Ⅱ组有不同程度的肝小叶结构破坏,肝细胞变性、坏死。染毒Ⅲ组,肝小叶结构有所修复,稍显混乱,肝细胞索排列欠整齐、有少量上皮样细胞结节出现:与染毒Ⅰ、Ⅱ组相比,染毒Ⅲ组肝细胞变性坏死程度有明显的好转。
3.染毒Ⅰ、Ⅱ组WBC较相应对照组分别增多38％、54％(P<0.05),其中以中性粒细胞增多为主,伴淋巴细胞减少；染毒Ⅱ组RBC数量、HGB含量及PLT数量较相应对照组分别增加12％、13％及45％(P<0.05)。
4.染毒Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组和对照Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组的血液生化学检查结果中除染毒Ⅲ组血清AST含量大于相应对照组19％(P<0.05)外,其它各组指标差异无统计学意义。染毒Ⅱ组HSI(3.30±0.62％)明显大于相应对照组(2.74±0.29％)(P<0.05),而其它各染毒组HSI与其相应的对照组相比差异无统计学意义。
5.染毒Ⅰ,Ⅱ组肝脏中Mn、Ca、Cu的含量较相应对照组分别高出67％、150％(P<0.05)； 29％、70％(P<0.05)；12％(P>0.05)、20％(P<0.01)；染毒Ⅰ、Ⅱ组和Ⅲ组肝脏中Mg、Fe、Zn含量与相应对照组相比分别降低18％、28％、25％(P<0.01)；52％、63％(P<0.05)、19％；14％(P>0.05)、26％、18％(P<0.05)。除Mg、Fe之外,染毒Ⅲ组与相应对照组相比上述指标差异均无统计学意义。
6.染毒Ⅰ、Ⅱ组肝脏匀浆中MDA含量,较相应对照组分别高出26％、78％(P<0.01)；染毒Ⅰ、Ⅱ组中GSH含量、T-AOC较相应的对照组分别降低24％、31％(P<0.01):39％、60％(P<0.01)；而染毒Ⅲ组与相应对照组相比,MDA、GSH、T-AOC均无显著差异(P>0.05)。
7.染毒Ⅰ、Ⅱ组血清中8-OHdG含量较对照Ⅰ、Ⅱ组分别增多4倍、8倍(P<0.01)；而染毒Ⅲ组与对照Ⅲ组相比上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。
8.肝脏超微结构:各组染毒大鼠有不同程度的核畸形,线粒体水肿,嵴溶解、断裂,脱基粒；粗面内质网结构紊乱,出现少量电子密度不均或较高的溶酶体,微绒毛形态改变。染毒Ⅱ、Ⅲ组肝细胞线粒体直径比相应对照组分别缩小了25％、20％。
9.染毒Ⅰ、Ⅱ组肝线粒体、细胞膜中Na+-K+-ATP酶活力为其对应的对照组的63.53％、52.00％；81.88％、78.51％(P<0.05)； Ca2+-Mg2+-ATP酶活力为其对应的对照组的72.87％、43.60％；79.62％、76.78％(P<0.05)； Cu2+-ATP酶活力为其对应的对照组的67.62％、50.79％:78.96％、69.04％(P<0.05)；染毒Ⅰ、Ⅱ组肝线粒体中SDH活力为其对应的对照组的67.40％、43.20％(P<0.05)；而染毒Ⅲ组与相应对照组相比上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。
10.染毒Ⅰ、Ⅱ组肝线粒体、细胞膜中GSH-Px活力为其对应的对照组的64.88％、61.51％；70.63％、70.37％(P<0.05)；染毒Ⅰ、Ⅱ组肝线粒体、细胞膜和细胞核中GSH含量为其对应的对照组的44.52％、51.60％、99.06％；41.79％、44.47％、62.17％(P<0.05)；MDA含量为其对应的对照组的144.47％、142.74、100.48％；202.91％、151.46％、174.52％(P<0.05)；而染毒Ⅲ组与相应对照组相比上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)。
结论:
1.给予大鼠MnCl2进行亚急性和亚慢性染毒后,肝细胞变性坏死,大鼠血液中WBC数量增多；肝脏组织中Mn、Ca、Cu含量增加,而Mg、Fe、Zn含量减少；肝脏组织中MDA含量升高:GSH含量、GSH-Px活力和T-AOC均下降；血清中8-OHdG含量增加。说明在剂量为6mg(Mn)/kg(BW)·d的MnCl2接触时,能导致肝脏损伤、肝脏中微量元素含量的改变、细胞核氧化损伤、脂质过氧化程度增加、抗氧化能力降低,其损伤作用具有时效关系。
2.肝细胞膜、线粒体和细胞核中MDA含量升高；GSH含量和GSH-Px活力均有不同程度的下降；细胞膜和线粒体中Ca2+-Mg2+-ATP酶活力、Na+-K+-ATP酶活力和Cu2+-ATP酶活力均下降,线粒体中SDH活力下降。说明在剂量为6mg(Mn)/kg(BW)·d的MnCl2接触时,能导致肝细胞亚细胞器损伤改变,其损伤作用具有时效关系。
3.MnCl2染毒所致的损伤在停止接触Mn30d后自行好转。