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糖尿病是一种由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱疾病。随着人们生活方式的改变，糖尿病的发病率在逐年上升，成为继心血管疾病和恶性肿瘤之后的第三大非传染性疾病。β细胞分泌的胰岛素是体内唯一能够降低血糖的激素，其生成、转运和释放过程需要多种蛋白的参与和调控，任何环节出现异常都可能打破体内的血糖平衡，从而引发糖尿病。所以精确地了解胰岛素的相互作用蛋白网络及调控机制对糖尿病的研究及治疗具有至关重要的意义。 为了克服传统方法在研究蛋白相互作用时会遗漏弱的相互作用或人为引入假阳性结果等缺陷，尽可能地展示生理条件的相互作用蛋白网络，在本课题中，利用优化了的抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidases，APEX2)在活细胞条件下标记胰岛素周围的蛋白质，从而研究胰岛素生物生成过程中的的相互作用蛋白网络。将APEX2插入到胰岛素的C肽区域，构建胰岛素与APEX2的融合表达质粒。利用逆转录病毒包装感染的方法，得到了稳定表达该融合蛋白的INS1细胞系。通过免疫荧光结果我们确定了该融合蛋白在细胞内的定位与内源性胰岛素基本一致，说明外源转入的proinsulin-APEX2在细胞内经历了正确的翻译、折叠、修饰及成熟等一系列过程。而后我们开展了生物素标记和DAB成像实验。在过氧化氢存在时，APEX2能够生物素标记目的蛋白周围的蛋白质。将生物素标记的蛋白富集后进行质谱鉴定，而后绘制了胰岛素生物生成过程中的相互作用网络。对质谱结果进行生物信息学分析显示，得到的蛋白主要参与囊泡蛋白的转运、ER蛋白的折叠、二硫键的形成、钙结合蛋白、膜结构的动态调节、囊泡的内容物及细胞黏附等过程。最后，我们会通过观察敲除关键蛋白后对胰岛素的影响，揭示胰岛素整个生成过程的分子机制，为糖尿病的治疗提供关键的指导方向。另外，在过氧化氢存在的条件下，APEX2还能够催化DAB聚集沉降，而后募集电子致密的锇，用于电镜观察。电镜结果显示:在内质网中，DAB信号分散于内质网腔内;而在高尔基体中，DAB的信号主要以膜结合的形式分布。之前，由于缺乏细胞内的超分辨成像方法，关于胰岛素原在高尔基体中分选形成囊泡的机制并不清楚，主要有“进入式分选”及“滞留式分选”两种假说。超分辨电镜结果首次直观地显示了胰岛素生物合成过程中其在内质网与高尔基体内的分布差异。在高尔基体内的膜结合分布状态，与“进入式分选”假说相吻合，为研究囊泡的生成机制提供重要的依据。 在本论文的第二部分中优化了APEX2的互补片段检测活细胞内特定的蛋白-蛋白相互作用。在细胞的整个生理过程中，蛋白质间的相互作用(protein-protein interactions，PPIs)发挥着这关重要的作用。蛋白片段互补法(protein-fragment complementation，PFC)是研究PPIs的一种有力的工具，但是PFC识别蛋白质相互作用区域的潜能还没有被优化。在本部分中，优化了“APEX2片段互补”的方法特异性地研究活细胞内蛋白质间的相互作用，同时标记蛋白质的相互作用区域。 根据APEX2的结构信息，构建了大量的APEX2-N端和C端的不同截断体，将其分别与FKBP12-rapamycin复合物的结合结构域(FKBP12-rapamycin binding，FRB)与FK506结合蛋白12(12kDa FK506-binding protein，FKBP12)相互融合。得到很多对FRB-NA与CA-FKBP。使得其单独表达时没有活性，在Rapamycin的诱导下，FRB与FKBP12相互作用，从而将NA和CA拉到一起，恢复完整的APEX2酶活性。通过分析DAB染色结果，我们成功筛选到一对符合要求的APEX2的互补对(N201+C202)。而后，通过免疫荧光及WB实验证明了该互补对模型可以在特定状况下重构APEX2的酶活性，满足我们对特异性的要求;为了进一步证明该互补对的特异性，将该互补对应用到STIM1同源二聚及Orail同源二聚的研究中;最终通过分析质谱鉴定结果，得到了5个在STIM1同源二聚时，STIM1自身被生物素化的位点，并且其都定位于已知的STIM1相互作用区域。这些结果表明，优化了一种可以在活细胞内，特异性地检测蛋白-蛋白相互作用，并且能够确定蛋白质间的相互作用区域的方法-APEX2片段互补法。