【摘 要】
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Duchenne肌营养不良症(DMD)是神经肌肉系统最常见的X-连锁隐性遗传病,由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因缺陷所致.Utrophin与抗肌萎缩蛋白有广泛的同源序列,具有相似的功能,增
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Duchenne肌营养不良症(DMD)是神经肌肉系统最常见的X-连锁隐性遗传病,由抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因缺陷所致.Utrophin与抗肌萎缩蛋白有广泛的同源序列,具有相似的功能,增加utrophin表达是治疗DMD的有效途径.我们的实验目的是建立一种能方便检测utrophin表达的方法,获得能用于筛选DMD药物的细胞模型.该文将Utrophin基因上18号和19号外显子及其周围的内含子序列,分成了三段克隆下来(片段Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ),每段长约2.0kb,并将能表达-Cys-Cys-X-X-Cys-Cys-结构的报告基因(TETC gene)插入到18号外显子中,然后将这三段序列按照Ⅲ→Ⅰ→Ⅱ的顺序重组到载体pGPKneobpA-LoxP-A上.经过电转化的方法,将构建好的质粒(pGPKⅠ,Ⅱ,Ⅲ)转染到C2C12细胞株中.经过细菌阳性对照实验,优化了荧光肽(TETC)与荧光染料FlAsH反应的条件.在已经转染的C2C12细胞中染色,发现了经FlAsH荧光染色后具有荧光的细胞,这些细胞正是能表达TETC的同源重组细胞.由于荧光肽(TETC)是和utrophin融合表达的,所以可以通过测定TETC来反映utrophin的表达,从而可以用来筛选能促进utrophin表达的药物,最终找出能有效治疗DMD的药物.该文通过同源重组插入报告基因,没有改变utrophin的读框,可以观察药物对所有utrophin调控元件的作用,明显优于以往的只能对单一调控元件进行检测的方法,而且该法检测方便,特异性高,是研究DMD良好的工具.
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