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第一部分中国汉族帕金森病患者LRRK2基因变异分析目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的发病机制尚不明确,目前认为与遗传因素、环境因素及老化等因素交互作用相关,其中遗传因素越来越受到关注。富含亮氨酸重复序列激酶2(leucine-rich repeat kinase 2 gene,LRRK2)突变是PD患者常染色体显性遗传中最常见基因突变,在家族性及散发性PD患者中均起着重要作用。对PD患者LRRK2基因变异分析及临床特点研究有助于进一步探索PD发病机制。本研究目的是探索汉族PD患者LRRK2基因罕见变异情况,并研究LRRK2基因G2385R和R1628P两个常见多态位点与帕金森病发生之间潜在关联,探索LRRK2“基因型-表型”(genotype-phenotype)之间关联现象。方法:1.连续收集296例中国汉族PD患者血液标本,提取基因组DNA,对其进行全外显子测序及靶向测序,测序均包括LRRK2基因的51个外显子及外显子一内含子交接区。将测序PD患者中LRRK2基因变异位点与643名年龄、性别匹配的健康对照组 in-house data 及 1000 Genome Project、Exome Aggregation Consortium 及dbSNP公共数据库进行比对,将最小等位基因频率小于0.5%的罕见变异,进行Sanger验证,研究中国汉族PD患者中LRRK2基因罕见变异情况,并用同种族的健康对照组in-house data过滤所发现的变异。2.在PD患者及健康对照组中,根据LRRK2基因G2385R和R1628P两个常见多态位点比例,研究其与帕金森病之间的潜在发病关联。3.对LRRK2常见变异组(n=56)、LRRK2罕见变异(n=16)及原发性PD患者(n=216)发病年龄、性别、运动症状、非运动症状(嗅觉减退、便秘、自主神经功能障碍、睡眠障碍等)进行全面评估,对比分析“基因型-表型”的关联。结果:1.我们的296例中国汉族PD中,在27例PD患者中发现了18个乙RRK2罕见变异位点,其中13个罕见突变位点首次在PD患者中被报道(M100T,L153W,A459S,S722N,R792K,C925Y,R981K,S1007T,V1447M,R1677S,N2308D,N2313S,N2313I),其他 5 个为已报道过的罕见变异 G2019S,R1325Q,A419V,P755L,R1320S。2.LRRK2基因G2385R和R1628P与中国PD人群发病关联研究发现:携带G2385R可增加PD患病风险(P<0.001,OR=2.707,卡方检验),而R1628P无统计学差异(P=0.532,OR=1.313,卡方检验)。3.PD患者中发现1例LRRK2 G2019S突变(之前在亚洲人群中罕有报道),经祖源分析,我们确认该患者为中国汉族。4.基因型与表型分析发现LRRK2基因突变可与中国汉族PD患者症状波动及嗅觉减退、便秘、RBD等非运动症状有关。结论:我们首次发现了中国汉族人群PD患者中LRRK2基因的13个罕见位点,提示LRRK2基因仍有很多潜在新的变异等待被继续发掘;携带LRRK2基因变异可与中国汉族PD患者症状波动及嗅觉减退、便秘、RBD等非运动症状有关。第二部分姜黄素对LRRK2 G2385R变异诱导细胞毒性的保护作用目的:我们的研究发现,富亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2 gene,LRRK2)基因G2385R位点变异是中国汉族人群帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者最常见的LRRK2基因变异位点,携带LRRK2 G2385R变异可使PD发病风险提高约2.7倍。目前对于LRRK2基因突变致病性的研究多着重于其对LRRK2蛋白激酶活性的改变所产生的影响。由于在欧美及高加索人群中,LRRK2 G2385R变异频率很低,对LRRK2G2385R变异的致病性、致病机制及潜在的保护性药物,目前均没有明确的研究。本课题研究中国汉族人群PD患者中LRRK2基因常见变异位点G2385R变异的致病性及相关的机制,并探索可能的保护性药物。方法:在人神经母细胞瘤细胞(human neuroblastoma cells,SH-SY5Y)中,分别将 Vector,Flag-wild-type(LRRK2 WT)以及 Flag-G2385R pcDNA3.1-LRRK2(LRRK2 G2385R)三种质粒与GFP(green fluorescent protein)按照15:1进行转染,荧光显微镜下计数轴突长度大于胞体长度2倍的细胞数,比较三组转染后的细胞毒性。在转染三组质粒的人胚肾细胞(human embryonic kidney 293,HEK293)中孵育 100μM H2O2,12h后用Mitosox Red进行染色,观察氧化应激对三组线粒体ROS水平的影响。使用Caspase gl0 3/7 检测 LRRK2 G2385R 是否增加 Caspase-3/7 活性。同时,在 SH-SY5Y细胞及小鼠胎鼠皮层原代神经元细胞中,用姜黄素(Curcumin)、CDK-5抑制剂Roscovitine、微管稳定剂Epothilone D进行预处理,研究其是否能够对LRRK2 G2385R诱导的细胞毒性起保护作用。并进一步通过Mitosox Red染色验证姜黄素是否能降低LRRK2 G2385R及H2O2诱导的线粒体氧化应激水平,同时用Caspase glo 3/7及Western blot检测姜黄素处理后的Caspase-3和PARP激活水平的改变。结果:1.在SH-SY5Y细胞中,与LRRK2 WT组相比,转染LRRK2 G2385R后SH-SY5Y细胞轴突损伤更严重,SH-SY5Y细胞中LRRK2 G2385R变异可致细胞毒性;2.孵育100μM H202 12h后,明显增加了LRRK2 G2385R变异诱导的线粒体ROS水平;3.LRRK2 G2385R 变异增加了 Caspase-3/7 活性;4.姜黄素对 K2 G2385R 变异诱导细胞毒性有保护作用,Roscovitine、Epothilone D对LRRK2 G2385R变异无明显保护性作用;5.姜黄素可降低LRRK2 G2385R与H2O2联合诱导的线粒体ROS水平。结论:LRRK2 G2385R变异可能通过改变细胞氧化应激水平,进一步促进凋亡等机制提高PD发病风险。另外,我们还发现了姜黄素可以作为活性氧清除剂,可能通过减少活性氧、抑制凋亡通路激活来保护LRRK2 G2385R诱导的细胞损伤。LRRK2 G2385R致病机制及保护性药物的研究对PD患者个体化精准治疗也有重要价值。