论文部分内容阅读
肌萎缩侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一种成年起病的慢性进行性运动神经元的退行性病变，患者以上、下运动神经元的选择性损害为特点，表现为进行性肌肉无力、萎缩，肌肉跳动和腱反射亢进、病理反射阳性等症状和体征。一般不影响感觉系统、智能和认知。中年男性多见，病后3～5年死亡。约10％的病例有显性遗传的家族史，其中20％与铜锌超氧化物岐化酶(Cu，ZnSuperoxidedismutase，SOD1)基因突变有关。目前已创建了几种表达突变人SOD1基因的转基因模型鼠，其中最早创建也是应用最广泛的是SOD1-G93A小鼠(简称ALS鼠)——它携带能表达人Gly93Ala(氨基酸链上第93位甘氨酸被丙氨酸替代)错义突变的SOD1基因，最终在小鼠发展为类人ALS的表现。在ALS中，突变SOD1的致病机制学说有：突变SOD1蛋白获得毒性功能、兴奋性氨基酸毒性、神经丝蛋白异常磷酸化和聚集、免疫、病毒感染等。
总的来说，ALS欠缺有效的治疗方式，目前许多研究者主要从如下3个方面挖掘有治疗意义的方法：药物治疗、基因治疗和细胞治疗。尽管迄今为止已筛选了几百种药物，只有力鲁唑被美国FDA认可为ALS的治疗药物，但是该药的作用还远未能达到增加ALS患者生存期的目的。部分细胞因子(脑源性神经生长因子等)在体外和动物实验中获得较为肯定延长运动神经元和模型鼠生存时间的疗效，但临床试验的结果却不乐观，可能与细胞因子在体内受到复杂因素的干扰有关。基因治疗包括与细胞因子、凋亡相关的基因策略，如利用病毒等载体携带相关基因进入病变组织并表达神经营养因子，该种方式使细胞因子较稳定地存留于靶组织，但病毒载体的潜在危险性，以及表达相关基因的稳定性如何，都是ALS移植鼠变性线粒体的百分率明显少于ALS对照组，在神经元胞体、树突和有髓鞘轴突内ALS移植鼠的线粒体变性的百分率比ALS对照组分别减少了25.89％，27.90％和42.26％。
(六)移植鼠体内Sry和神经细胞标记的免疫荧光检测结果FISH检测结果显示，在高倍镜下小鼠Y染色体荧光为绿色或黄绿色，呈点状或线样分布于胞核内。检测发现，脊髓中这些带Sry荧光标记的细胞散在分布，数量少。对同一移植鼠来源的约5～10个系列/只的连续切片进行了细胞标记和神经标记物的对比分析，结果为：在每个系列的连续切片上带Sry标记(移植细胞标记)的细胞占一定视野中细胞总数百分率的均值为5.45‰±0.35‰(约1/200个细胞)，约80％的标记细胞同时表现为神经标记物阳性，其中GFAP阳性细胞占标记细胞的72％±6.1％，NF阳性细胞占标记细胞的8.8％±6.07％。
四、骨髓干细胞的体外迁移实验(一)ALS鼠组织内MCP-1的表达量RT-PCR扩增得到MCP-1及其内参的表达量情况：ALS鼠中枢神经系统和正常鼠脊髓组织中均表达MCP-1，肝脏组织不表达。图像分析结果显示，MCP-1表达相对量，从少到多依次为：正常脊髓，ALS脑、脑干和脊髓。WesternBlot进一步证实了RT-PCR的结果，并进一步显示19周龄ALS病鼠各组织中MCP-1表达量较8～9周龄ALS鼠的明显增高(P＜0.01)。
(二)骨髓干细胞的体外游走实验利用Transwell系统进行骨髓干细胞体外游走实验的研究，对各组迁移到下室的骨髓干细胞进行计数，显示：ALS脊髓组的下室细胞数最多，而MCP-1阻断组中下室细胞数较前者明显减少，但仍然高于正常脊髓组。流式细胞分析迁移细胞CKR-2B(MCP-1受体)结果显示空白对照组的CKR-2B表达率不到50％，正常脊髓组和ALS脊髓组中，两组细胞CKR-2B表达率接近，统计无显著性差异(P＞0.01)，在细胞群间比较，单核细胞群的表达量比淋巴细胞群的更高(P＜0.01)。
结论1、B6SJLSOD1G93A/+鼠(ALS转基因鼠)在行为学、电生理学、和病理学上的特点与人类ALS疾病非常相似，因此ALS转基因鼠是研究人ALS疾病机制和治疗策略的理想动物模型。
2、本研究中所采用的放疗移植方案——对7～9周龄ALS鼠行5.5～6.5Gy放射预处理一周左右进行静脉移植同种异基因骨髓干细胞——是安全可行的(创新点一)
3、骨髓干细胞移植治疗可明显延长ALS鼠的生存期达5周左右，并延缓显著发病时间(创新点二)。
4、运动功能检测、电生理学、病理学和生化学等指标显示移植鼠的残存运动神经元及其功能较同龄ALS对照鼠明显增加，证实骨髓干细胞移植治疗ALS鼠是有效的(创新点三)。
5、ALS脊髓组织中MCP-1表达异常上调，体外细胞游走实验的研究结果证实ALS鼠脊髓匀浆中的MCP-1可显著增加骨髓干细胞的游走能力，提示骨髓干细胞跨血脑屏障迁移至局部病变脊髓的机制可能与MCP-1的趋化作用有关。(创新点四)