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背景与目的严重的牙周病最终会导致牙周支持组织缺失,近年来,组织工程技术成为研究的热点。组织工程主要包括三个要素：种子细胞,生物支架材料以及各种细胞因子。但由于种子细胞的来源受限,移植后细胞的存活比例低以及成瘤性、免疫排斥反应等问题,其转化为临床应用尚存在许多障碍。原位组织工程技术的发展可以规避传统组织工程的缺陷。原位组织工程可以通过具有趋化募集干细胞作用的趋化因子来实现。在缺损局部增加趋化因子的浓度,可促进功能细胞归巢至创区,从而为组织修复提供细胞来源。另外,还可通过全身应用细胞因子动员骨髓干细胞进入血液,进一步促使更多干细胞归巢至缺损区。基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)和甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)的联合可使这一策略成为现实。SDF-1是一种重要的细胞趋化因子,在医学其他领域已有众多研究。CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4)是SDF-1的受体,表达于多种干／祖细胞表面,可与SDF-1耦合介导其迁移。在损伤局部应用SDF-1可促进血循环中CXCR4+干细胞及前体细胞到达创伤部位。本课题组前期实验已经证实SDF-1对牙周膜干细胞有趋化及促增殖分化的作用。局部应用SDF-1可显著促进间充质干细胞及造血干细胞归巢至牙周创区,促进血管生成,减轻炎症反应,增加新骨体积和密度,增强新生骨质量,是原位组织工程中具有应用前景的一种趋化剂。PTH是一种骨质疏松治疗药物,可促进骨的合成代谢。在细胞水平,间歇应用PTH可促进骨衬里细胞分化为成骨细胞,使成骨细胞的数量增加,从而增加I型胶原及骨钙蛋白等成骨相关基因表达,促进骨再生。PTH还具有干细胞动员作用,能够促进骨髓来源的祖细胞迁移至外周血。另外,PTH还能促进机体自身SDF-1水平升高,进而通过SDF-1的趋化作用促进骨髓中的成骨细胞归巢。鉴于本课题组的前期研究基础以及上述SDF-1和PTH的理论基础,我们推测通过全身应用PTH和局部应用SDF-1的联合,能够对干细胞起到最大程度的募集和动员,即全身应用PTH将骨髓中的干细胞动员到血液中并升高机体自身SDF-1水平,同时局部增加外源性SDF-1,促进干细胞归巢至牙周创区,从而形成新的牙周支持组织。本实验建立了大鼠双侧下颌骨牙周开窗缺损的模型,通过全身应用PTH和局部应用SDF-1,观察二者结合对大鼠牙周缺损区间充质干细胞募集、SDF-1受体CXCR4表达以及牙周组织再生的影响。材料与方法1、PTH与SDF-1联合对大鼠牙周缺损区MSCs 及 CXCR4+细胞募集的影响建立雄性Wistar大鼠双侧下颌骨牙周开窗缺损模型,左侧缺损内放置含5pgSDF-1的胶原膜,右侧放置含PBS的胶原膜作为对照组。大鼠被随机分为数量相等的两组,其中一组于术后隔日腹腔注射PTH (40μg/kg),另一组腹腔注射等量生理盐水。在术后3天、1、2、4周取大鼠下颌骨标本,制作石蜡切片,行免疫荧光双染(CD90+/CD34-)并通过显微镜进行阳性细胞计数,行SDF-1受体CXCR4免疫荧光染色并计算阳性细胞数量,以检测PTH与SDF-1联合对大鼠牙周缺损区MSCs及CXCR4+细胞募集的影响。2、PTH与SDF-1联合对缺损区内牙周组织再生的影响建立大鼠牙周开窗缺损模型后,于术后3天、1、2、4、8周取下颌骨标本制作石蜡切片,行H&E染色,计算新生骨面积百分比,测定新生牙周膜纤维角度,并观察牙骨质再生情况,确定PTH与SDF-1联合应用对大鼠牙周缺损区牙骨质、牙周膜及牙槽骨再生的影响。免疫组织化学染色检测成骨相关蛋白碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、成骨分化关键性调控因子runt相关转录因子-2(runt related transcription factor 2, Runx2)、I型胶原(collagen, Col I)的表达,并进行TRAP染色检测破骨细胞数量,通过IPP6.0软件测定图片的平均光密度并进行阳性细胞计数,比较缺损愈合过程中各组和各时相之间成骨及破骨反应的差异。结果1、PTH与SDF-1联合对大鼠牙周缺损区MSCs及CXCR4+细胞募集的影响术后实验动物全部成活,无明显炎症和免疫排斥反应发生。通过对石蜡切片的CD90+/CD34-免疫荧光双染后行阳性细胞计数,结果表明,在各个时间点PTH与SDF-1联合所募集的MSCs均较其他组多,差异有统计学意义(P<0.05)。CXCR4免疫荧光染色后细胞计数结果显示,在创伤愈合前期阶段,PTH+SDF-1组CXCR4+细胞较其他组为高,差异有统计学意义(P<0.05)。2. PTH与SDF-1联合对缺损区内牙周组织再生的影响牙周缺损区H&E染色结果显示,PTH与SDF-1联合可促进创区早期成骨,且形成的牙槽骨骨髓腔较少,骨质致密,新生骨面积高于其他各组且有统计学差异(P<0.05)。成骨相关蛋白免疫组织化学染色结果表明,PTH与SDF-1联合可促进牙周缺损愈合早期阶段ALP和Runx2表达,与其他各组有统计学差异(P<0.05)。在愈合后期,PTH+SDF-1组Col I表达量较高,与SDF-1组无明显差异(P>0.05),但高于PTH组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。TRAP染色结果显示,PTH与SDF-1联合可激活早期破骨细胞生成,促进骨的合成代谢。牙周膜纤维和牙骨质新生出现在愈合后期(4、8周),PTH+SDF-1组新生牙骨质在第4周时已出现,至第8周时明显较其他组厚。通过将各组新生纤维角度与天然牙周膜角度相比较,发现在第8周PTH+SDF-1组的新生牙周膜纤维角度最近于天然牙周膜。结论1、PTH与SDF-1联合可促进更多的MSCs募集至牙周缺损区,为组织再生提供干细胞来源；并能促进CXCR4+细胞迁移至创区,说明PTH可提高SDF-1的水平,从而增强SDF-1的作用。2、PTH与SDF-1联合能够显著促进愈合过程中牙周组织再生,促进早期破骨细胞活跃,调节骨的平衡和稳态,还能促进成骨相关蛋白Runx2、ALP、Col I的表达,提高新生骨质量,同时改善新生牙周膜纤维的质量,并促进新生牙骨质形成。