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研究背景及目的:Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在介导生长因子信号中发挥重要作用。Akt调控细胞周期进程,在细胞存活、生长与增殖、糖代谢以及染色体稳定性等生物过程中发挥重要功能。众多研究已经表明,Akt与肿瘤的发生、发展密切相关,是介导肿瘤代谢Warburg效应的重要分子,是一种重要的癌基因。因此,研究Akt蛋白激酶的分子调控机制具有重要的理论价值和潜在的临床应用价值。尽管已有大量文献报道G1-S期Akt相关信号通路的调控机制,但G2/M期Akt的分子调控机制尚不清楚。APC/C泛素E3连接酶作为G2/M期细胞周期演进的最主要调控分子复合体,通过Cdc20和Cdh1这两个激活分子(Activator),分别识别底物分子的D-box、KEN-box序列,对底物分子进行泛素化修饰,致使蛋白酶体依赖性的底物分子降解,促成细胞周期演进。本研究旨在揭示G2/M期Akt活性变化,探讨APC/C对Akt活性的调控作用及其分子机制。研究方法:(1)用Nocodazole(诺考达唑)对细胞进行同步化处理,使细胞周期阻滞于G2/M期,采用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)加以验证。(2)G2/M期同步化后的细胞继续生长,使细胞进入不同的细胞周期时相,采用免疫印迹法(immunoblot)检测细胞周期不同时相Akt的活性。(3)采用immunoblot检测Cdh1和Cdc20在细胞周期不同时相中的表达水平。(4)RNA干扰Cdh1和Cdc20表达水平后,采用immunoblot检测干扰Cdh1和Cdc20的G2/M期Akt磷酸化水平的变化。(5)为探索Cdh1和Cdc20调控G2/M期Akt活性的具体机制,采用immunoblot检测Akt上游调控分子,包括PI3K各亚基以及mTORC2复合体各组成成分在G2/M期的表达水平,并采用免疫共沉淀方法(Co-immunoprecipitiation,Co-IP)检测mTORC2复合体形成在G2/M期的变化。(6)用Etoposide(依托泊苷)处理同步化或未同步化的细胞,采用immunoblot和FCM方法比较细胞周期不同时相对细胞凋亡敏感性的影响。研究结果:(1)Akt在细胞周期的G2/M期位于S473和T308位点的磷酸化水平明显降低,同时Cdh1和Cdc20在G2/M期表达高水平,提示APC/C可能参与G2/M期Akt活性的调控。(2)G2/M期mTORC2复合体的形成减弱,为G2/M期Akt活性减低提供了机制解释。(3)干扰Cdc20后,G2/M期细胞Akt的磷酸化水平显著增高。(4)Akt的上游含有D-box或KEN-box序列的调控分子例如PI3K亚基以及mTORC2复合体各组分在G2/M期的表达水平与其它细胞周期时相相比无显著区别,提示APC/C不是通过这些已知分子在G2/M期调控Akt的活性的,APC/C调控G2/M期Akt活性的具体机制还有待进一步探讨。(5)G2/M期Akt活性降低的细胞更容易发生Etoposide诱导的细胞凋亡。研究结论:G2/M期的Akt活性调控机制仍不甚明了。本研究发现G2/M期Akt S473和T308这两个位点的磷酸化水平显著下降,提示Akt活性在G2/M期的显著下调。Akt在G2/M期活性的下降伴随着mTORC2复合体形成减弱以及APC/C激活分子Cdc20和Cdh1表达增加,RNA干扰降低Cdc20的表达显著增强G2/M期Akt的磷酸化水平,从而首次揭示Cdc20在G2/M期对Akt活性的调控作用。G2/M期Akt活性的下降使细胞更容易发生药物诱导的细胞凋亡。