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基因组DNA转录形成RNA,再由RNA翻译形成蛋白质是生命活动的基本过程,对细胞的生长、代谢和凋亡起着重要作用。核酸作为调控生理活动的基本遗传物质,携带着生命活动的遗传信息,对所有生物体的生长、发育、遗传和变异等重大生命现象起着决定性作用。其中,microRNA是一类内源性的、非编码的长度相对较短的小RNA,microRNA通过与目标信使RNA(mRNA)特异结合从而抑制蛋白翻译或诱导mRNA降解,在调控基因表达、细胞增殖分化凋亡过程等方面发挥着重要作用,其表达含量异常与多种疾病尤其是癌症的发生密切相关。另外,由单核苷酸多态性(SNPs)所引起的基因突变,通常可引起一定的表型变化,SNPs的分析检测在致病机理研究、基因功能研究以及个性化用药等方面具有重要意义。此外,特定位点的mRNA突变直接决定了翻译蛋白的功能,与包括癌症在内的多种疾病的发展密切相关,近年来肿瘤相关mRNA突变作为评估肿瘤细胞在生物体内或血液中迁移的特异性生物标志物得到高度重视。因此microRNA及基因突变的检测对基因功能研究和以其作为生物标志物的遗传病学研究、疾病诊断尤其是癌症的早期诊断与治疗等都具有十分重要的意义。针对上述重要的核酸标志物,本论文通过创新设计新颖、实用的新型核酸扩增技术,发展了一系列简便、灵敏度高、特异性好的microRNA及基因突变的定量检测分析方法。主要研究内容如下:(1)发展了一种新颖的由目标物引发的环介导等温扩增反应(TT-LAMP)用于高灵敏度microRNA分析。在该研究中,通过巧妙地设计含有茎环结构的模板DNA(SLTD)和引物(SLP),在microRNA存在的情况下只需要一步延伸反应即可形成双茎环哑铃状DNA结构,该双茎环DNA作为后续LAMP反应的起始物质完成信号扩增。与传统LAMP扩增机制相比,该TT-LAMP方法高度简化了探针设计,缩短了模板的长度,提高了双茎环DNA结构的生成效率,从而显著提高了 TT-LAMP的检测灵敏度。且该方法全程仅需要一种DNA聚合酶,即可实现低至100aM(1 zmol)的目标microRNA的灵敏检测,并能够对靶标分子的单碱基差异实现较好的区分。MicroRNA的灵敏和准确检测对其生物功能研究和生物医学应用具有重要意义。(2)虽然TT-LAMP方法取得了较好的检测结果,但在双链DNA分析及对单碱基差异的区分等方面仍受到限制。基于此,我们建立了一种基于连接反应的LAMP扩增的分析方法,实现了SNPs的高选择性分析。连接酶介导的连接反应对单碱基突变具有优异的识别特性,我们将连接反应和LAMP相结合,以待检测的突变型DNA为模板,巧妙地设计两条分别含有目标基因特异性识别序列及用于LAMP扩增的茎环结构序列的DNA探针。当突变型目标DNA存在时,探针与其完全互补,被连接生成具有双茎环哑铃结构的DNA连接产物,作为循环扩增的起始物质进行后续LAMP扩增。当以野生型DNA为模板时,由于与探针末端碱基不匹配,探针无法连接所以无法进行后续扩增反应。基于连接反应的LAMP方法取得了很高的灵敏度和特异性,可检测到10 aM的突变DNA,并能在野生序列的背景下识别低至0.1%的突变DNA。在此基础上,我们进一步在连接探针3’端倒数第3个碱基处引入额外错配碱基,当连接探针末端碱基与突变型目标DNA匹配时,错配碱基不会影响末端连接反应,LAMP可以正常进行扩增;但当以野生型DNA为模板时,由于与探针的3’末端碱基不匹配以及倒数第3个错配碱基的协同作用,可进一步有效减少非特异性扩增。基于修饰探针的连接LAMP分析方法,在保持了高灵敏度的同时(可以检测低至10 aM的突变DNA),可在大量野生型背景下高选择性地检测到低至0.01%的突变DNA,这对于基因功能研究和疾病诊断,尤其是癌症的早期诊断具有重要意义。(3)近年来,肿瘤相关mRNA突变作为评估肿瘤细胞在生物体内或血液中迁移的特异性生物标志物已得到高度重视。同时,单细胞中mRNA突变的精确测定对于深入揭示癌症发展的复杂性和异质性也具有重要意义。这都需要对超低拷贝数突变mRNA进行高选择性的精确定量检测。基于此,本论文通过结合肽核酸(PNA)对于单碱基变异高选择性的识别能力和液滴式数字PCR(ddPCR)超灵敏、精确定量的优点,发展建立了一种针对突变mRNA的超灵敏、高特异性的微滴数字反转录PCR(ddRT-PCR)方法。该方法能够在单细胞和单分子水平上精确定量检测mRNA突变,低至1 aM的突变mRNA可以被准确地检测到。且具有超高的特异性,可在野生型mRNA高背景下清晰地识别低至0.01%的突变mRNA,更重要的是,即使在血清复杂基质中不影响低拷贝数的突变mRNA检测。该方法由于单分子水平的灵敏度以及超高特异性,在单细胞水平上研究细胞异质性,以及利用mRNA突变作为生物标志物进行液体活检相关的生物医学研究均具有重要意义。