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术后认知功能障碍(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是指手术麻醉后数天内发生的意识、认知、定向、思维、记忆以及睡眠等方面的紊乱,是一种可逆的、具有波动性的急性精神紊乱综合征;通常又被称为术后精神障碍、术后谵妄等。POCD是脑功能暂时性机能障碍,可导致死亡率增加、康复延迟、并发症增多、住院天数延长和医疗费用增加等,严重时甚至影响病人出院后的生活质量。POCD常发生于老年人,最早发现于老年病人心脏手术后,近年来发现在非心脏手术病人也有较高的发生率,目前日益受到研究者的关注。由于诊断标准不同,观察病人例数不同,POCD发生率的报道也不一致。大量研究发现,POCD多发生于65岁以上的老年患者,发病率约为3%-61%,是年轻患者的2-10倍。Seymour等研究显示,年龄大于75岁的老年病人POCD的发生率比年龄在65-75岁的病人高3倍。Moller等通过对1218例非心脏手术老年病人36个月的调查发现,术后1周POCD的发生率与年龄增加、麻醉时间延长、受教育程度低、二次手术、术后感染和呼吸系统并发症等许多因素有关,但术后3个月POCD的发生率仅与年龄有关。POCD确切的发病机制尚不明确。国外研究证实,POCD常常是多种因素协同作用的结果。易发因素包括高龄、高血压、糖尿病、长期服用某些药物、酗酒、感官缺陷、心理和环境因素等。促发因素包括应激反应、创伤、手术、术中出血和输血、脑血流降低、脑血管微栓子的形成、低血压、术后低氧血症、血压波动以及电解质紊乱等。患者存在的基础疾病如糖尿病、高血压、冠心病、脑梗死与POCD的发病关系密切。有学者认为,与老年性痴呆的发病机制一样,POCD可能是在神经系统老化的基础上,由麻醉、手术等外界因素诱发或加重的退行性改变,其发病机制是多种因素的综合作用。文献研究报道低血压和低氧血症并不影响POCD的发病率,因此更多的研究转向了手术创伤本身是否引起POCD.既往研究认为全麻患者POCD的发生率要高于椎管内麻醉和局麻患者,近年研究表明,老年人POCD与麻醉方式间无明显相关性。Williams对全膝关节置换术患者随机实行全身麻醉和硬膜外麻醉,在术后1周和6个月POCD发生率无明显区别。美国20个医院的一项对年龄大于60岁髋关节骨折患者的回顾性研究发现,麻醉技术(全麻和局麻)对术后精神状态没有影响。几项假说提出来解释POCD的可能机制,但现在还不清楚POCD的发生是否直接与手术创伤有关。已有文献证实创伤应激能激活外周的免疫系统,引起炎性因子的释放,导致认知功能的破坏。与年龄相关的炎性因子表达改变也有报道,包括炎性因子IL-1β, IL-6和TNF-α表达的增加。大量的研究证实,中枢系统炎性因子表达增加,尤其是在海马区可导致长时程增强效应(long term potentiation, LTP)的破坏和海马介导的认知功能的损伤。手术创伤激活外周免疫系统引起炎症反应,释放各种炎性因子。免疫学研究发现组织损伤可激活巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和内皮细胞。这些细胞的激活是对组织损伤最早期的分子反应,释放各种炎性介质,包括各种因子,补体和氧自由基,比如IL-1,IL-6和TNF。外周炎性因子通过直接激活转运系统或者间接通过刺激迷走神经两种途径透过血脑屏障。外周炎性因子进入和影响中枢神经系统的机制需要进一步的研究。在正常生理情况下,炎性因子在中枢神经系统不表达,在病理状态下表达迅速升高。外周的炎性因子通过直接或者间接途径作用于中枢神经系统。炎性因子可结合中枢神经系统相应的受体,激活小胶质细胞和血管内皮细胞,引起一系列的炎症反应和其它效应。外周的炎症反应与手术患者神经认知功能的下降有关。手术创伤不仅激活外周的免疫反应,同时也激活中枢神经系统的免疫反应。外周的炎性因子、术前的微小栓子和应激反应都可以引起炎症反应。以往研究发现,炎性反应最重要的标志是小胶质细胞的激活。与巨噬细胞作用相似,小胶质细胞就如同一个清道夫,在受到刺激时会产生炎性因子。感染、缺血和炎症反应通过多种分子机制激活小胶质细胞。激活的小胶质细胞可释放可溶的炎性分子,包括炎性因子、类花生酸类物质、补体、兴奋性氨基酸、过氧化物和NO。Wan发现脾切除术引起胶质细胞激活导致海马区炎性反应,伴随着认知功能的下降。但至今还没有很好的方法解释手术创伤引起的炎性反应。Kalman发现冠脉搭桥的患者脑术后一周脊液炎性因子IL-6明显升高,术后6个月抗炎因子IL-4明显升高。这显示免疫调节反应参与了术后神经系统的损伤和心脏手术术后的并发症。炎性因子引起认知功能下降可通过影响神经递质的产生、影响突触可塑性和神经毒性发挥作用。因此手术创伤引起的中枢神经炎症反应或者外周炎症反应可引起POCD。本研究拟探讨手术创伤对老年鼠和成年鼠术后认知功能和海马区炎症因子表达的影响。材料与方法一、成年鼠和老年鼠手术创伤模型的建立成年鼠和老年鼠分别随机分为对照组(每组12只)、麻醉组(每组36只)和手术组(每组36只)。所有实验动物都维持室温23℃,黑白周期12小时轮转,给与充足的食物和水。在实验结束后处死实验鼠后粗率检查老鼠有无明显疾病(脾测量法和有无肿瘤)。不健康的大鼠排除。所有动物都在这样的环境熟悉7-10天。对照组SD大鼠均不做特殊处理。麻醉组实验动物单纯接受1.5-2%异氟醚麻醉,然后行气管插管和机械通气。手术组SD大鼠行肝部分切除术。具体步骤：手术切口处备皮、消毒,在上腹部正中线做一小切口,游离切除左侧肝脏,伤口用0.25%布比卡因浸润,然后用缝线缝合,所有手术步骤均无菌操作。手术待老鼠恢复后放回笼子里各自饲养。麻醉组和手术组分别在术后1、3、7天利用反转的morris水迷宫进行行为学测试。试验结束后,测试完毕的老鼠1/2断头处死后立即取海马放在液氮中保存测量mRNA,剩余的1/2处死后经心脏灌注肝素化的生理盐水,然后在体灌注4%多聚甲醛,动物的脑组织被取出置于4%多聚甲醛中做免疫组化。二、空间记忆能力-Morris水迷宫一个直径1米水深30厘米的圆形水槽(水温24-26℃),一个圆形的透明平台置于水面下0.5厘米,水槽四周贴有如正方形、菱形等不同的图形,实验鼠要根据这些图形确定它的游行线路来找到水面下的平台。老鼠在手术前六天进行训练,每天三次,每次实验时,首先将实验鼠放在平台上30S,让其熟悉周围环境,然后让头部背对平台随机放入水槽的四个象限,自由游泳60S,或者找到平台,如果在60S内没找到平台,引导它找到平台,在平台上待30S,重复上述实验。在第7天实行肝部分切除术,术后第1、3、7天重复Morris水迷宫实验,不同的是将平台放在对面的象限,让实验鼠放在上面熟悉30s。这种倒转的水迷宫测验老鼠能否迅速学习和记忆平台的位置。置在水迷宫上方的摄像机连接计算机,记录游泳的速度、到达平台的时间和游行距离。三、免疫组织化学海马组织做5umm石蜡切片,载玻片上免疫染色。常规脱蜡至水,3%过氧化氢灭活内源性酶,热修复后,正常山羊血清封闭,神经胶质酸性蛋白(GFAP)、S100β和突触素分别用兔抗GFAP抗体(博士德)、小鼠抗S100β抗体(博士德)、兔抗突触素抗体(博士德)4℃过夜,切片在室温下用磷酸盐缓冲液冲洗三次。生物素化山羊抗兔IgG或者羊抗小鼠IgG 25℃孵育2h, SABC37℃孵育20 min,室温下DAB显色,镜下控制反应时间,以阳性产物呈棕黄色,背景淡棕色为度。苏木素复染,显微镜观察,照相。每只动物每隔5张取1张切片,共取5张利用图像分析管理系统进行图象分析统计处理。四、RNA的提取和通过定量RT-PCR测量海马区细胞因子mRNARNA的提取：所有RNA都是用Trizol试剂从匀浆海马组织中分离提取。cDNA的合成：cDNA的合成主要利用RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒合成。PCR扩增：2ul的cDNA在50ul的反应液里用2U的Taq多聚酶进行扩增。反应液包括5ul 10*PCR缓冲液,1.5mmMgCl2 buffer, dNTPs(各0.2 mM),以及0.4mmIL-1β、IL-6和TNF-1α的基因特异性引物。PCR扩增。在PCR扩增目的基因时,加入一对内参照β-actin的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照。5ul的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。条带密度采用凝胶图像分析系统定量。mRNA的量由特异性基因的]mRNA和β-actin(一种看家基因)mRNA的比值来表示。五、统计学分析RT-PCR和免疫组化所得的数据实行两因素方差分析,年龄(成年、老年)和干预因素(对照、手术)作为因变量。术前Morris水迷宫每次计算所得到数据使用重复测量方差分析。术后Morris水迷宫计算所得到数据实行两因素方差分析。若方差分析揭示结果有统计学意义,则使用post hoc Student’s t检验。所得数据以x±s表示,P<0.05认为有统计学意义。结果一、老年鼠和成年鼠游行的速度、到达平台的时间和游行距离利用重复测量方差分析六天的训练数据显示,时间(p<0.001)和年龄(p<0.001)在到达平台的时间和游行的距离上有统计学差异(图1A&1B),在游行速度上没有统计学差异(图1C)。这些结果证明随着训练时间的增多,老年鼠和成年鼠都能改善空间记忆和学习能力,但老年鼠需游行更长的时间和更远的距离才能到达平台。游行速度上无统计学差异说明老年鼠游行时间和距离的增加并不是因为运动能力下降造成的。利用翻转的morris水迷宫检测实验鼠手术后的空间记忆和学习能力。分析到达平台的时间和游行的距离显示年龄(p<0.001),手术(p<0.001)和年龄×手术(p=0.047,p=0.054,)均有统计学差异(图2A&2B),游行速度在年龄和手术之间没有差异(图2C)。成年鼠的空间记忆学习能力(到达平台的时间和游行的距离)在术后第1天(p<0.001)受到破坏,在术后第3天恢复(p=0.848,p=0.973,)。老年鼠的空间记忆学习能力(到达平台的时间和游行的距离)在术后第1天(p<0.001)受到破坏,并且持续到术后第3天(p=0.002,p=0.001),在术后第7天恢复。单纯的麻醉药物并没有明显破坏实验鼠术后的认知功能。这些数据说明手术创伤破坏了实验鼠的空间记忆和学习能力,并且高龄易化了这种破坏,老年鼠认知功能破坏表现的更强烈,持续时间更长。二、手术创伤对海马区炎性因子表达的的影响利用两因素方差分析海马区炎性因子mRNA的表达变化,年龄(p<0.001),手术(p<0.001)和年龄×手术(p<0.001, p<0.001 and p=0.003)在IL-1 p,IL-6和TNF-α上有统计学差异(图3A-3C),成年鼠和老年鼠海马区IL-1p,IL-6和TNF-α在基础水平存在统计学差异(p=0.041,p=0.012和p=0.035)。单纯麻醉因素没有明显改变成年鼠和老年鼠海马区炎性因子的表达。成年鼠海马区IL-1p和IL-6仅在手术后第1天(p<0.001)明显增高,但老年鼠海马区炎性因子增多持续到手术后3天(p<0.001,).(图3A&3B)。TNF-αmRNA仅在老年鼠手术后1天(p<0.001)明显增加,成年鼠在任何时间点都没有明显改变(p=0.095)(图3C)。这些结果证明手术创伤可明显增加海马区炎性因子的表达,这种改变尤其在老年鼠明显。三、手术创伤对海马区GFAP和S100p蛋白表达的影响本实验探讨成年鼠和老年鼠在手术创伤后炎性因子表达差异的原因,我们利用免疫组化探讨了海马区GFAP和S100β蛋白表达的变化。两因素方差分析显示年龄(p<0.001)、手术(p<0.001)和年龄×手术(p<0.001)对GFAP和S100β表达有统计学差异,GFAP和S100β在成年鼠和老年鼠在基础水平也有统计学差异(图4A&4B)。当增加的GFAP阳性细胞在成年鼠术后第3天(p=0.09)恢复后,老年鼠GFAP阳性细胞在术后第3天(p<0.001)仍然明显增加,在术后第7天(p=0.823)恢复(图4A)。S100p有与GFAP同样的变化趋势(图4B)。四、手术创伤对海马区CD200和CD200R mRNA表达的影响为了探讨手术创伤激活海马区胶质细胞的潜在机制,我们测定了海马区CD200和CD200R mRNA的表达变化。CD200在成年鼠和老年鼠术后第一天表达下调(p<0.001),术后第三天恢复正常(p=0.067,p=0.582)(图5A)。在任何时间点,手术创伤并没有明显改变成年鼠和老年鼠CD200R mRNA的表达水平(图5B)。这些结果证明手术创伤引起的胶质细胞激活部分机制可能是因为激活了海马区CD200 mRNA的表达。结论1、手术创伤而不是麻醉因素导致了术后认知功能障碍,高龄加剧了认知功能的破坏。2、手术创伤导致了海马区炎性因子IL-1p,IL-6和TNF-a的表达,老年鼠炎性因子表达更加剧烈,持续时间更长。炎性因子的表达同术后认知功能改变平行,可能介导了术后认知功能障碍。3、手术创伤引起海马区胶质细胞的激活,老年鼠比成年鼠激活更加明显,持续时间更长。4、手术创伤导致海马区CD200表达下降,外周手术创伤引起的海马区胶质细胞的激活部分机制是由于CD200表达下调。