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研究背景和目的淋巴瘤尤其是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL)是一类组织形态和类型复杂多变的肿瘤,而不同的病理类型具有不同的临床表现及治疗反应,因此分型诊断一直是病理诊断的重点和难点,也是人们不断研究探索的焦点。近年来随着研究的深入及资料的积累,多种类型淋巴瘤得到明确区分,但是对套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma,MCL),人们一直没有明确的认识。MCL是淋巴瘤中较少见,但特异的一种类型,文献报道约占NHL的3%～10%,以50～70岁的男性多见。该瘤发病隐匿,大部分患者就诊时多已呈弥散性病变,80%的病人处在Ⅲ期或Ⅳ期,明确诊断时大约有70%的病例已累及骨髓、外周血,临床进展较其他几类形态上类似的小B细胞淋巴瘤(B-SLL、FL、MZL)更快,在上述淋巴瘤中预后最差,预后甚至比恶性程度较高的弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large b-cell lymphoma,DLBCL)还差。因此MCL的正确诊断、与其他小B细胞淋巴瘤的鉴别诊断,对正确地预见患者的发展规律、预后评估并选择适宜的治疗方案具有重要的临床病理学意义。组织形态学是病理诊断最直接、最主要的依据,然而在实际工作中,当组织处理不当或形态不典型时,仅凭形态学表现作出明确诊断分型具有一定的困难,往往要借助其他相关指标的检测辅助诊断。目前免疫标记的检测在淋巴瘤的诊断中具有十分重要的地位,不仅可以鉴别组织的良恶性,而且特定的标记有助于进一步确诊分型。研究发现CyclinD1蛋白在MCL中高表达,是MCL的主要诊断及鉴别诊断指标。然而实际工作中由于标本的前期处理以及固定方式的影响,造成抗原活性降低或丢失,免疫组化检测CyclinD1蛋白的表达阳性率不高,文献报道为60%～70%,部分形态不典型的阴性表达病例不易确诊分型。近年来各种分子生物学技术迅速发展,尤其是基因及染色体异常检测技术,已在淋巴瘤的诊断中被广泛应用。免疫球蛋白重链(immunoglobulin heavy chain,IgH)基因重排是淋巴细胞特有的生物学变化,良性组织表现为多克隆重排,恶性淋巴瘤则表现为单克隆或寡克隆重排,而且不同类型的淋巴瘤有特定的重排形式。检测IgH基因重排不仅有助于良恶性的鉴别诊断,对于不同类型淋巴瘤的细胞起源也有一定的预示意义,而且IgH基因重排与淋巴瘤中常见的几种染色体畸变有关。染色体畸变是淋巴瘤种的常见事件,其中染色体t(11;14)(q13;q32)易位是MCL最具特征性的遗传学改变,该易位导致CyclinD1蛋白的高表达,几乎所有的MCL均有这种染色体异常。世界卫生组织认为,检测遗传学异常是恶性淋巴瘤诊断分型最可靠的指标,在分子遗传学水平检测染色体t(11;14)(q13;q32)易位,对于MCL的诊断更为敏感和特异。目前常用的检测方法有传统的细胞遗传学染色体核型分析、Southern印迹法、PCR检测等,但各有缺陷,限制了应用。新的遗传学方法荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH),对细胞分子遗传学的诊断有重要价值,传统FISH采用超薄切片,容易造成遗传信息丢失,而且价格昂贵,难以在国内开展应用,本课题组前期建立的细胞核微阵列FISH法检测染色体易位具有高效,经济的特点,适宜于在实验与临床中开展应用。本研究以收集的MCL标本为主要研究对象,同时以形态上与之相似的其他几类小B细胞淋巴瘤(包括B-SLL、MZL、FL、MALT)作对照分析,从组织形态、免疫表型、IgH基因重排及染色体t(11;14)易位检测等诸多方面进行了研究分析,旨在为MCL的病理诊断提供敏感、特异的诊断指标和方法,对临床治疗和预后提供更多的信息。方法1.临床资料收集及形态、免疫表型分析收集南方医院2002年至2006年五年间收治的经外科手术病理确诊为NHL的标本412例进行整理分类,从中选取MCL及形态上与之类似的其他几类小B细胞淋巴瘤,同时从“广东省淋巴瘤协作组”组成单位收集标本,共收到标本118例,进行形态及免疫表型分析。2.IgH基因重排检测从收集的标本中选取组织丰富的淋巴瘤标本63例(MCL 31例、B-SLL 13例、MALT 8例、FL9例、MZL2例),另取慢性扁桃体炎10例做对照,采用半巢式PCR检测IgH基因重排。在PCR模板的制备方法上,采用了试剂盒提取法、直接消化水煮法和本研究新建立的细胞核水煮法三种方法对比分析;并对扩增产物采用普通琼脂糖电泳(agar gel electrophoresis,AGE)和毛细管电泳(Capillaryelectrophoresis,CE)检测进行对比分析。3.染色体t(11;14)(q13;q32)易位检测对本课题组前期建立的细胞核提取及核阵列制作方法进行适当改进,细胞核的提取采用改良水浴加热脱蜡法替代前期常温脱蜡法,核阵列的制作采用直接点阵法替代前期蜡膜打孔点阵法。采用普通PCR、半巢式PCR及本课题组前期建立的细胞核微阵列荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)法,检测73例标本中染色体t(11;14)(q13;q32)易位,并对不同检测方法所得结果进行对比分析。4.统计学方法不同方法检测率之间的比较采用x2检验,样本均数之间的比较采用单向方差分析(one-way ANOVA),多组样品间的相互比较采用多重比较分析。统计软件使用SPSS13.0统计软件包。结果1.MCL与NHL临床资料及形态、免疫表型结果(1)本组412例NHL中小B细胞淋巴瘤为62例,占15.05%,其中MCL仅4例,占NHL的0.97%。(2)免疫表型分析结果显示,采用EDTA高压煮沸进行抗原修复,以及在抗原修复前用0.4%的胃蛋白酶对组织进行适当消化,可以提高CyclinD1检测的阳性率,CyclinD1的表达在MCL中的阳性检测率为76.47%,显著高于其他几类小B细胞淋巴瘤。2.MCL及小B细胞淋巴瘤中IgH基因重排检测结果(1)三种石蜡包埋组织DNA提取方法中,细胞核水煮法提取的DNA含量最高,其纯度较试剂盒提取的DNA稍低,但高于直接消化水煮法。AGE检测,试剂盒提取的DNA完整性最好(＞5Kb);细胞核水煮法提取的DNA片段＞2Kb,电泳条带清晰;直接消化水煮法提取的DNA则为弥散、小片段。细胞核水煮法提取的DNAβ-globin扩增阳性率为87.50%,低于试剂盒提取法,但高于直接消化水煮法。(2)CE检测MCL中IgH基因重排阳性率为90.32%(28/31)高于AGE检测阳性率(83.87%),1例B-SLL、3例FL和3例慢性扁桃体炎标本,AGE检测为单条带,经CE检测证实为多克隆性重排。(3)IgH基因重排检测的阳性率在MCL和B-SLL中较高,分别为90.32%和76.92%;在FL、MALT和MZL中则较低,分别为44.44%、42.86%和50.00%。3.MCL及小B细胞淋巴瘤中染色体t(11;14)(q13;q32)易位检测结果(1)采用普通PCR检测MCL中t(11;14)(q13;q32)易位阳性率仅为25.81%(8/31),采用半巢式PCR检测阳性率为35.48%,较普通PCR有所提高。(2)采用改良水浴加热脱蜡法提取的细胞核杂质少、质量佳;直接点阵法制作的核阵列背景干净,细胞核分布均一。(3)核阵列FISH法检测t(11;14)(q13;q32)易位,阳性率为93.10%(27/29),所做FISH图像背景低,信号强,定位准确。结论1.CyclinD1是MCL的一个特异性标志,抗原修复前用0.4%的胃蛋白酶适当消化,可以提高其检测阳性率,但仍有部分阴性表达病例难以确诊分型。2.本研究建立的细胞核水煮法提取石蜡包埋组织DNA,具有简便、高效、低成本及高DNA得率的优点。3.CE检测PCR扩增产物可以对AGE检测的可疑结果进行校正。4.本研究建立的改良细胞核提取及核阵列制作方法优于本组前期建立的方法。5.t(11;14)(q13;q32)易位是MCL诊断及鉴别诊断的特异性指标;FISH较PCR检测t(11;14)易位灵敏度和特异性更高,尤其是细胞核阵列FISH方法具有简便、高效、经济的特点。创新之处:1.在石蜡包埋组织DNA提取中,提出了细胞核水煮法,并在本次研究中应用得到了理想结果。2.采用CE检测PCR结果,校正了AGE检测的可疑结果。3.对细胞核的提取及核阵列的制作进行了适当改进,提高了质量,简化了操作。