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研究背景肌腱病(Tendinopathy)是目前运动医学及骨科学面临的主要伤病之一。在美国，每年有1640万人肌腱和韧带有损伤，至少10万人是跟腱病。肌腱病病因包括许多内在和外在因素，其中反复、过度的应力负荷是肌腱病发展过程中主要致病因素。应力负荷包括不同应变、频率及时间三种因素。高运动频率可能是肌腱病发生的主要相关因素：Kujala等提出跟腱病累积发病率在中长跑运动员中比较高，跟腱断裂累积发病率在短跑运动员中较高(中长跑运动员运动频率约为3.0Hz,短跑运动员运动频率约为4.5Hz)；吴子英等提出低频率牵伸对受损跟腱有修复作用，而高频率牵伸可造成跟腱病的发生。过度应力负荷可能是TSCs异常分化的主要原因之一。Zhang和Shi提出不同应变及时间对TSCs分化有影响，但目前不同频率对TSCs增殖分化影响不清楚？在体外细胞循环牵伸载荷模型中，单轴牵伸模型较好模拟体内TSCs受力情况，被用于研究应力负荷条件下TSCs对肌腱病的影响。目前体外细胞单轴循环载荷模型主要有STREX系列、Wang及我们课题组曹洪辉前期研制的牵伸模型，但以上牵伸模型频率参数均较低，不能满足本课题的实验条件，且在其它方面也存在需改进的地方。研究目的建立一种多频率新型单轴循环牵伸模型；确立适度及过度牵伸频率阈值，初步探讨不同牵伸频率对TSCs增殖分化的影响，为进一步研究运动负荷对肌腱病的影响提供实验依据。方法一、多频率单轴循环牵伸载荷模型的建立1、硅树脂培养皿制备及有限元分析用PDMS制备微沟槽细胞培养皿；有限元软件ABAQUS对新设计及前期设计硅树脂细胞培养皿进行分析。2、机械部分运行稳定性及有效牵伸性能测试观察牵伸模型机械部分运行稳定性；检测培养皿实际运行频率及被牵伸前后应变位移量变化；LSCM观察TSCs被牵伸前后F-actin形态变化。二、牵伸频率对体外培养SD大鼠TSCs增殖分化的影响1、SD大鼠来源TSCs分离、培养与鉴定①流式细胞仪检测TSCs增殖能力；②流式细胞仪及激光共聚焦观察干细胞标志物表达情况；③化学诱导法观察TSCs多向分化能力。2、观察和检测牵伸频率对TSCs形变和增殖的影响3、real-time PCR和Western blot检测牵伸频率对TSCs分化的影响结果一、新培养皿应变分布均匀，牵伸模型操作简便，设计参数宽1、TSCs在标准细胞培养板上和在硅树脂材料上增殖无显著差异(p＞0.05)；当槽深为3μm时，较适合规范TSCs生长取向；新设计的硅树脂培养皿在应力、位移及应变分布方面优于前期设计的培养皿。2、机械部分运行稳定；培养皿被牵伸前后弹性无明显变化；牵伸组TSCs无明显脱落；培养皿实际运行频率、位移距离和设定频率及理论应变位移距离比较无明显差异(P﹥0.05)；牵伸组F-actin束变细且部分发生断裂、解聚。二、牵伸频率对TSCs增殖、分化有影响1、TSCs具有干细胞特性①TSCs成集落样克隆性生长；②流式细胞仪检测CD90及CD44(+)，CD106及CD11b(-)；免疫荧光检测Ⅰ型胶原(+)、Ⅲ型胶原(-)、SSEA-4(+)、Nucleostemin (+)；③茜素红染色后，细胞内有较多的钙结节形成；油红染色后，胞浆内大量红染脂滴；甲苯胺蓝溶液染色后，见蓝染酸性糖胺聚糖。2、牵伸频率对TSCs形态、生长方向及增殖有影响①在底膜光滑的硅树脂皿中，牵伸组TSCs外形由鹅卵石样变为长梭形，生长方向与牵拉轴方向大致相同；在带微沟槽的硅树脂皿中，TSCs呈长梭形沿微沟槽方向排列生长；②低频率牵伸对TSCs增殖无影响(P﹥0.05)；高频率牵伸使TSCs增殖下降(P﹤0.05)。3、牵伸频率对TSCs分化有影响低频率牵伸对TSCs成肌腱、成骨分化无影响(P﹥0.05)；高频率牵伸使TSCs向成肌腱方向分化降低，而向成骨方向分化增加(P﹤0.05)；牵伸频率对TSCs成脂肪及软骨分化无影响(P﹥0.05)。结论1、新制备的硅树脂培养皿应变分布均匀，是一种较理想的用于贴壁细胞牵伸实验培养皿；多频率牵伸模型设计参数宽、操作简便，适用于体外贴壁细胞生物力学载荷实验研究。2、SD大鼠来源TSCs具有一般干细胞特性；低频率牵伸对TSCs增殖和分化无影响；高频率牵伸使TSCs增殖下降及向成肌腱方向分化降低、成骨方向分化增加。