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前言 胃癌的发生是一个多步骤、多阶段的过程，它涉及到多种癌基因、抑癌基因、错配修复基因、端粒端粒酶、细胞粘附因子等的异常和积累。PTEN是1997年美国三个实验室先后在10q23位点发现的一个新的肿瘤抑制基因，它是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。迄今研究发现，机体多种肿瘤中存在PTEN基因突变、缺失或甲基化等遗传学改变，本研究将探讨胃癌及癌前期病变中PTEN的缺失和失活。在肿瘤分子生物学研究上另一个受到高度重视的基因变异类型是DNA错配修复基因功能的失活，主要表现为微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)，胃癌是MSI发生率最高的恶性肿瘤，但由于微卫星位点的选择及结果判定标准的不同，使得MSI阳性率有很大差异，本研究将根据国际MSI工作站的要求，选择同样的微卫星标记点，用同样的判定标准来探讨从癌前期病变到胃癌的发生过程中MSI的变化。由于PTEN第7，第8外显子的编码序列存在(A)6重复单位，它可作为MSI作用的靶位点，本项研究将会探讨胃癌中PTEN基因突变与MSI的关系，从而明确PTEN可否作为MSI作用的靶基因。 材料和方法 一、材料 1．病例选择 收集中国医科大学附属一院2001年-2002年胃镜中心活检标本及肿瘤外科术后大体标本胃癌及癌前病变和相对应的正常胃粘膜各30例，上述标本经OCT包埋固定，立即置于液氮罐中，-70℃冰箱中永久保存。 2、PTEN LOH引物D10S215，D10S541，D10S2491以及MSI微卫星标记位点BAT26，D2S123，D5S346，D17S799，D18S34引物序列均由WWW.gdb.org上查询获得；Exon5和Exon8引物序列由参考文献中获得，上述引物均由北京奥科公司合成。 3、PCR所用Taq DNA聚合酶、缓冲液、dNTP、Marker、一次性耗材等均购自大连宝生物公司。 4、免疫组化S一P试剂盒、鼠抗人单克隆抗体浓缩液(1:200)购自福州迈新公司。 5、2400 PCR扩增仪、BIO一RAD垂直电泳槽:美国PE公司。琼脂糖电泳仪:北京分析仪器厂。TG一16台式离心机:上海分析仪器厂。恒温水浴箱:南京化学仪器厂。 二、方法 1、饱和氯化钠法提取组织DNA。 2、PCR一SSCP变性聚丙烯酞胺凝胶电泳检测PTEN杂合性缺失。 反应体积为20林l，含引物0.4林M，10 x BtlfferZ闪(含Mg，+2.OnunoFL)，dNT咫oomM，TaqDNA聚合酶1单位，基因组DNAZoong。反应条件为:95℃预变性smin，94℃455，55℃455，72℃605，进行35个循环，72℃延伸10而n。PCR产物按1:5与变性缓冲液混合，97℃变性10而n后立即置于冰水中，16%聚丙烯酞胺凝胶电泳4小时，(丙烯酞胺:甲叉丙烯酞胺29:1，含7moFL尿素)，电泳后银染，观察结果。若肿瘤组织较正常组织相比，条带缺失或减弱75%以上者可判定为杂合性缺失。 3、PCR一SSCP银染一ABI测序系统检测PTEN基因突变 pCR反应体积为20衅，含引物2 .5林M，1 0 x Bu月笼rZ闪(含Mg，+2.0~oFL)，dNTpZOomM，TaqDNA聚合酶1单位，基因组DNAZoong。反应条件为:95℃预变性sniln，94℃455，58℃305，72℃605，进行35个循环，72℃延伸10min。PCR产物经12%聚丙烯酞胺电泳，银染，突变带通过ABI测序系统进行测序。 4、PCR一SSCP变性聚丙烯酞胺凝胶电泳检测Msl 具体方法同2。结果判定:与正常组织相比，胃癌及癌前期病变组织有额外的DNA等位片段或出现等位片段泳动，即可判断为MSI。其中1个位点发生MSI为MSI一L，2个或2个以上位点发生MSI为MSI一H，没有MSI发生为Mss。 5、S一P免疫组化法检测Pl下N蛋白表达 结果判定标准:细胞浆内见清晰棕褐色颗粒者为PTEN表达阳性细胞。每例切片选5个高倍视野，按阳性细胞数占同类计数细胞的百分比，将免疫组化结果分为:阴性(一)，<5%;弱阳性(十)，5%一25%;+)，25%一50%;强阳性(一)，>50%。 三、统计学处理 实验结果数据资料以又土SD表示，差异显著性采用sPe~an分析等级资料。中度阳性(+检验，应用实验结果 一、PrEN杂合性缺失 胃癌及癌前期病变中PTEN杂合性缺失的比率见表一 表一胃癌及癌前期病变中Pl，EN杂合性缺失 病变D105215 D105541 D1052491总缺失率萎缩性胃炎3.3%(l/30)3.3%(l/30)6.7%(2乃。)ro%肠上皮化生3.3%(l/30)3.3%(1/30)3.3%(1乃O)10%不典型增生6.7%(2/30)3.3%(l/30)6.7%(2乃O)13.3% 胃癌早期胃癌6.7%(2/30)10%(3/30)6.7%(2/30)20%进展期胃癌13.3%(4/30)6.7%(2/30)13.3%(4乃0)30% 二、件EN基因突变 在所有的癌前期病变及早期癌中均未出现PTEN基因突变，在进展期胃癌中，Exons检测到1例突变，Exons检测到2例突变。具体突变情况见表二。 表二PrEN在胃癌中的突变病例外显子LOH密码子碱基改变临床分期病理 ns+ 91 GAAtoCAAlll。印戒细胞癌 198+335 CGA to TGAll低分化腺癌 228+329 Del 4 bp Illb未分化癌 ·3·三、PTEN蛋白的表达PTEN蛋白的表达强度及表达率见表三，具体表达情况见图5一10。