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葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH,zwf1和zwf2)是磷酸戊糖途径中第一个酶(“看家”酶),也是形成NADPH的关键酶.zwfl和zwf2分别编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的二个异构酶.
本课题以此酶作为研究对象,研究了在阻断或者加强此酶的表达后,对龟裂链霉菌合成土霉素的影响.
首先,把zwf2克隆到pSETl52质粒上,经过鉴定,成功构建了特异性整合质粒pSET152-zwf2.再通过大肠杆菌GM2929去甲基化,采用电转化方法,把质粒pSET152-zwf2转入龟裂链霉菌M0418感受态细胞中.通过载体上的attP和宿主菌中的attB发生特异性双交换,使pSET152-zwf2整合到宿主菌龟裂链霉菌M0418的基因组上,得到了zef2敲入转化子M0418-(zwf2),并进行了PCR鉴定和点杂交鉴定.
其次,把一部分的zwf2克隆到温敏型pKC1139质粒上,经过鉴定,成功构建了单交换整合质粒pKC1139-zwf2.再通过大肠杆菌GM2929去甲基化,利用接合转移的方法,把质粒pKC1139-zwf2转入龟裂链霉菌M0418中,通过载体上部分的zwf2和宿主菌中的ZWf2发生单交换整合,使pKC1139-zwf2整合到宿主菌龟裂链霉菌M0418的基因组上,得到了阻断转化子M4018-△zwf2.
最后,对M4018.(zwf2)、M4018-△zwf2和原始菌M4018三菌株进行发酵.从G6PDH比酶活结果来看,无论在指数生长期,还是在发酵结束时,M4018-(zwf2)的G6PDH的比酶活都是最高的,而M4018-△zwf2却只有原始菌的一半左右.
从细胞生长的情况来看,M4018-(zwf2)的最终干重为9g/L,比其他两株菌都高.在发酵结束时,M4018-(zwf2)中的葡萄糖已经耗完,而其他两株菌均有残留.但是M4018-△zwf2生物合成土霉素的能力却是加强了,在发酵结束时,M4018-△zwf2中的土霉素浓度为79.78mg/L,比原始菌提高了27％,比M4018-(zwf2)提高了40％.
此外,从单位菌体的土霉素产物系数(OTC/DCW,g/g)比较,M4018一△zwf2的OTC/DCW为9.67mg/g,比原始菌M4018和M4018-(zwf2)分别高了31％和52％.在单位葡萄糖的土霉素得率系数(OTC/glucose)方面,M4018一△zwf2的OTC/glucose比原始菌M4018和M4018-(zwf2)分别提高了29.6％和51.1％.
这些数据表明M4018-△zwf2中zwf2的失活有利于细胞合成土霉素.但是单位葡萄糖的菌体细胞得率系数(DCW/glucose)比较,M4018-(zwf2)是最高的,这又表明zwf2被加强表达后,会使细菌生长得更好.
综上所述,zwf2的失活会影响葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的正常表达,从而使细胞生长的速度大大地减缓了,但是有利于土霉素的生物合成.这可能是由于更多葡萄糖从HMP途径转入EMP途径,从而可以合成更多的乙酰辅酶A-土霉素的前体.