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目的:家蚕基因组框架图完成以后,家蚕功能基因组研究工作的大量开展需要提供不同发育时期、不同分化程度、不同组织特异性的家蚕细胞系作为研究平台。为了满足家蚕细胞生物学、发育生物学和分子生物学研究、体外蛋白质表达载体系统以及家蚕细胞工程及转基因家蚕研究等方面的需要,我们开展了建立和研究新的家蚕细胞系的工作。 丝腺是家蚕最重要的器官之一,通常认为丝腺是生产单一蛋白的一种理想模型系统,所以,这种细胞的体外培养将有助于研究丝素和丝胶的生物合成机制。通过家蚕丝腺的细胞培养,还可以尝试开发丝素体外生产系统。而且丝腺细胞在幼虫期就不再分裂,幼虫的丝腺细胞是终端分化细胞,因此丝腺细胞系的建立对于终端分化细胞的去分化机制的研究提供了良好的材料。 方法:在无菌条件下,以家蚕夏芳×秋白品种蚁蚕为材料,取丝腺组织制作原代培养物,以Grace S培养基培养,补加15%的胎牛血清。经210d左右的原代培养后进行传代培养,以后每隔约15d传代一次,后传代时间缩短到10天,当传代时间稳定在7天时细胞开始趋于稳定,此时鉴定细胞系的生物学特性。 结果:细胞维持体外生长1年多时间,传至25代。细胞呈长梭形,贴壁生长。细胞在接种的48h到168h内呈指数生长,临界增殖浓度为1.0×10~5个细胞/毫升。该细胞系的染色体具有鳞翅目昆虫染色体的典型特征,中期染色体呈短杆状或颗粒状,其着丝粒是弥散型着丝粒。二倍体细胞(2n=56)比例高达76.28%,属二倍体细胞系,少量细胞染色体异倍化。但是大部分细胞仍然较好地保持了家蚕细胞的有丝分裂和染色体特征。 我们采用了ISSR技术和RAPD技术对蚕丝腺细胞系BmSG-SWU1进行了指纹图谱分析,鉴定了家蚕丝腺细胞系,并且构建了3个家蚕胚胎细胞系(BmE-SWU1、BmE-SWU2、BmE-SWU3)、BmE-SWU1的原代培养材料蚕种夏芳×秋白的胚胎以及其它五种传代细胞系(BmE、BmN、sf9、sf21和Hi5)共9个样品的DNA指纹图谱,获得了9个样品的DNA指纹图谱和三个胚胎细胞系各自特有的DNA标记;测定了各样品间的Nei相似系数和遗传距离,构建了系统发育树,本实验通过两种分子标记的扩增结果表明,在体外培养的过程,胚胎细胞系的基因组DNA与原蚕种基因组DNA扩增产物除了有部分相同分子大小的DNA条带外,还有各自独特的DNA条带。即家蚕胚胎细胞系与其家蚕