【摘 要】
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腺苷(Adenosine,AD)在人体生理活性中起重要作用。例如,AD可以调节心肌的心脏氧消耗和血流量,并通过AD受体调节脑神经递质如多巴胺的释放。此外,它可以帮助调节平滑肌收缩、
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腺苷(Adenosine,AD)在人体生理活性中起重要作用。例如,AD可以调节心肌的心脏氧消耗和血流量,并通过AD受体调节脑神经递质如多巴胺的释放。此外,它可以帮助调节平滑肌收缩、神经传递、肾血液动力学和凝乳酶的释放等。在正常生理条件下,痕量的AD被释放到细胞外空间以发挥其重要的病理生理作用。然而,当氧供应平衡受到干扰时,大量的AD被释放到体液/血液中。因此,检测AD的含量对于了解人体的状态是非常有必要的。碳点(Carbon dots,CDs)是尺寸小于10 nm的球形颗粒。目前,由于CDs具有良好的水溶性,良好的生物相容性,低毒性,优异的光稳定性和强荧光发射等性质而备受关注。因为CDs优良的物理和化学性质,CDs常用来进行传感。适配体是指通过指数富集配体系统进化得到的核酸序列,其有很多优点,例如,容易合成,稳定性好,亲和性好和易修饰。因此,基于适配体标记的CDs有很多优点,如稳定性好、灵敏度高和选择型好。目前,尚未报道AD适配体修饰的CDs来检测AD。本论文以检测生物样品中痕量AD为目的,以AD核酸适配体修饰的CDs(CDs-aptamer)作为AD的荧光探针,同时以纳米石墨(Nano-graphite,NG)作为荧光猝灭剂,构建了能够高选择性、高灵敏度地检测生物样品中痕量AD的荧光传感平台,并成功应用于尿样中痕量AD的检测。概要如下:1.CDs-aptamer/NG传感平台的构建CDs表面有羧基,AD适配体的5’端修饰了氨基,活化羧基与氨基反应生成酰胺键,形成CDs-aptamer复合物。在CDs-aptamer溶液中加入NG,因为aptamer和NG之间的π-π相互作用,CDs-aptamer吸附到NG表面,并且CDs-aptamer的荧光发射光谱和NG的紫外吸收光谱有重叠,因此发生荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET),CDs-aptamer 的荧光被猝灭。当AD加入到CDs-aptamer/NG系统中,AD和AD适配体特异性结合形成双链DNA(dsDNA)结构,CDs-aptamer从NG表面脱落,FRET中断,CDs-aptamer荧光恢复。根据CDs-aptamer的荧光恢复程度与AD浓度的自然对数值的线性关系,实现对样品中AD含量的定量检测。实验优化了 CDs-aptamer复合物合成以及传感平台应用的反应物比例、温度、时间等条件,最后通过傅立叶红外光谱,琼脂糖凝胶电泳以及高分辨透射电镜对所制备的荧光传感平台进行了结构和形貌表征,证明CDs-aptamer/NG传感平台的成功构建。2.CDs-aptamer/NG传感平台的应用基于CDs-aptamer和NG的荧光传感平台,我们建立了一种高灵敏度、高选择性测定尿液中AD含量的方法。干扰实验表明,CDs-aptamer/NG传感平台具有良好的选择性。研究结果表明,在最佳实验条件下,当AD浓度在2-50 nM范围内,构建的传感平台的荧光强度的相对变化值与AD浓度的自然对数值呈良好的线性关系,相关系数为0.9925,检测限为0.63 nM。在该方法建立的基础上,采用标准加入法,测得实验室志愿者的尿液中AD的含量为226.4 nM,AD的加标回收率均在97.5-107.3%之间,且相对标准偏差小于8.3%(n=3)。实验结果表明,构建的off-on型荧光传感平台能够满足复杂生物样品中AD的分析测定要求。本论文设计的荧光传感平台操作便捷,经济、绿色环保、测定复杂生物样品时仅需进行过滤稀释处理便可实现对样品中所含AD的快速分析测定。
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