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化石能源的短缺以及对开发新能源的需求使得木质纤维素类生物质的综合利用越来越受到国内外的广泛关注。各种高效木质纤维素降解菌的分离、产酶条件优化、酶学特性、产酶机理研究以及利用基因工程技术改造和构建工程菌株是目前研究和开发的重点。半纤维素作为木质纤维素的主要成分之一,其开发利用对于提高生物质的综合利用和降低生产成本有重要意义。
本论文以自制半纤维素为单一碳源筛选获得一株高效的木聚糖酶产生菌,经鉴定命名为Aspergillus niger BE-2。采用Plackett-Burman实验设计分析了影响该菌产木聚糖酶的显著因子,结果显示各因素影响的显著性水平为温度＞发酵时间＞起始pH＞Vc＞CaCl2＞蛋白胨＞Tween80,其中温度和发酵时间对产酶量影响较显著。利用响应面法优化该菌液态发酵产木聚糖酶的条件。优化后的最佳产酶条件为38℃,pH4.9,96 h。优化后的发酵产木聚糖酶活性显著提高,粗酶液酶活性最高可达174 IU/mL,且该菌株明显表现为一株耐高温产酶菌。
酶反应特性研究表明,菌株BE-2木聚糖酶作用的最适温度为55℃,最适pH为5.0,且在一定温度和pH范围内,酶活性保持相对稳定,适合工业应用。利用HPLC分析菌株木聚糖酶酶解半纤维素的产物,结果显示,菌株BE-2对蔗渣半纤维素的降解效率较高,降解的主要产物为木糖,还有部分低聚木糖(包括木二糖、木三糖和木六糖)、阿拉伯糖和葡萄糖。不同酶添加量以及不同酶解时间下,各种产物的产量变化趋势表明适当增加粗酶液添加量和缩短酶解时间有利于低聚木糖的产生。在50 mL反应体系中,酶添加量为300 IU/g,酶解2 h时低聚木糖产量最高。推测该菌阿拉伯糖苷酶、木糖苷酶以及非阿拉伯糖依赖型的内切木聚糖酶活性较高。
利用双向电泳技术分析了该菌诱导与阻遏条件下的胞外蛋白表达差异。利用MALDI-TOF鉴定了高表达量的25个差异蛋白点。其中17个蛋白肽段经过数据库比对得到了鉴定结果,从而找到部分参与降解半纤维素的木聚糖酶以及参与木聚糖酶调控的蛋白水解酶类。