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当今世界，核能在工业、国防、科技、医疗等领域的普及应用，它在造福人类的同时，也不可避免的给世界带来严重的核辐射危险，不仅对环境造成污染，更重要的是给人类的健康安全带来了严峻的挑战。我国核能技术飞速发展，不仅拥有核武器、核潜艇等国防力量，而且拥有大量的核电站。2011年日本福岛核电站因里氏9.0级地震而泄露在对日本造成巨大危害的同时也给我国带来了核恐慌。现代生物学技术不断前进，放射治疗是目前临床恶性肿瘤治疗的常用方法之一。但越来越多临床证据表明：电离辐射在杀伤肿瘤细胞的同时，不可避免的会造成对正常组织的损伤。尽管现代放疗技术和方法都有很大发展，这一副作用仍严重影响放疗在临床上的应用。放射性肺纤维化是胸部肿瘤患者放射治疗中常见的并发症，也是核与辐射突发事件中受大剂量照射伤员常见的病理损伤，是导致肿瘤病人放疗失败和急性放射病伤员病程后期的主要死因之一。国内外对放射性肺纤维化虽然进行了多年的研究，但辐射导致肺纤维化发生的机制尚不十分清楚，由于机制不清至今在临床上还未找到防治放射性肺纤维化良好的医学处置方法。因此，针对放射性肺纤维化发生过程中的某个关键环节作为靶点，以探讨电离辐射(ionizing radiation, IR)与肺纤维化的关系及其机制，为防治肺纤维化的研究提供新的思路和方案。肺纤维化以肺泡上皮细胞受损以及成纤维细胞/肌成纤维细胞聚集为特征，并有胶原及其他细胞外基质沉积，最终影响正常肺组织修复过程及细胞外基质异常沉积而导致纤维化发生。由于肌成纤维细胞在这一病理过程中起重要作用，所以它的起源是肺纤维化研究的热点和关键点。研究表明，在损伤因素刺激下，上皮细胞可逐渐失去上皮特性并获得成纤维细胞等间质细胞特性，即发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。在特发性肺纤维化的动物模型以及病人标本中，都发现EMT的存在。在某些因子参与和诱导下，与EMT相关性及特异性转录因子被活化，特异性细胞膜蛋白表达增强，细胞骨架蛋白发生重构，细胞外基质降解酶发生改变以及特异性微小RNA的变化等等细胞内分子水平的变化都可引发并维持EMT。电离辐射是诱导EMT的重要因素之一。已有研究显示microRNA-200c可以抑制EMT，而TBK1是miR-200c直接靶点。因此，探讨TBK1与IR, EMT发生的相关性，以及TBK1作用的机制，将为明确放射性肺纤维化发生提供重要的实验依据。本研究选取肺泡上皮细胞作为实验对象，通过EMT标志物等指标研究IR对EMT的影响，并围绕TBK1表达水平的变化，对TBK1进行干扰，进一步明确TBK1及其下游信号通路在IR诱导EMT中的作用。研究内容：1、辐射对肺泡上皮细胞上皮间质转化的影响：采用人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)和大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN)为研究对象，给予不同照射剂量，选取不同照射时间，观察在此条件下EMT标志物变化情况，建立辐射诱导EMT细胞模型；2、干扰TBK1对辐射诱导肺泡上皮细胞上皮间质转化的影响：①脂质体转染siTBK1，明确干扰效果；②干扰TBK1后选择适当剂量及时间照射，观察EMT变化；3、TBK1对辐射诱导肺泡上皮细胞上皮间质转化的作用机制探讨：①干扰TBK1，观察辐射诱导EMT细胞模型中EMT相关转录因子的变化；②TBK1作用可能相关信号通路探讨。实验方法：1、采用人肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549)和大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(RLE-6TN)，对其进行2、4、6、8、10Gy60Co γ射线照射，通过Western Blot (WB)实验技术，检测EMT标志物，建立辐射诱导EMT细胞模型；2、通过WB检测辐射对细胞TBK1表达水平的影响；3、利用lipo2000脂质体转染法干扰细胞中TBK1的表达，用WB及Real-time-PCR检测转染效果；4、干扰TBK1，通过WB，免疫荧光实验检测EMT标记物变化，评价TBK1对IR诱导EMT影响；5、干扰TBK1，采用Real-time PCR和WB检测EMT相关转录因子的变化；以及过表达转录因子ZEB1对TBK1调节IR诱导EMT的效应；6、干扰TBK1，采用Real-time PCR检测照射后细胞TGF-β表达变化；通过WB实验，观察TGF-β/Smad3通路是否参与TBK1的调节；7、干扰TBK1，采用WB检测照射后细胞NF-κB通路表达变化，观察其是否参与TBK1的调节；8、干扰TBK1，采用WB检测照射后细胞GSK-3β的表达变化，通过给予GSK-3β特异性抑制剂SB216763，观察GSK-3β在TBK1调节IR诱导EMT中的作用；联合过表达转录因子ZEB1，探讨TBK1和GSK-3β的关系。9、统计方法：采用t检验；方差分析等， P＜0.05即有统计学差异意义。实验结果：1、8Gyγ射线照射72h后，两种肺泡Ⅱ型上皮细胞均呈现出间质细胞样变化，发生EMT，表现为：与正常对照组相比，上皮标志物E-cadherin表达降低，间质标志物Vimentin表达增高，提示8Gy照射后72h能够诱导细胞EMT的发生；2、两种细胞经8Gyγ射线照射后，TBK1的表达水平呈时间依赖性升高；3、用lipo2000转染siTBK1后，与对照组相比，TBK1表达水平明显下降；4、8Gyγ射线照射72h后，与对照组相比，干扰TBK1可以调节IR诱导EMT的发生。表现为：上皮标志物E-cadherin表达上调，间质标志物Vimentin表达下调；5、8Gyγ射线照射72h后，EMT相关转录因子如ZEB1等表达上调；干扰TBK1后，与单纯照射组相比，转录因子ZEB1表达下调，同时过表达ZEB1可以逆转干扰TBK1的效应，提示TBK1调节IR诱导EMT可能是通过转录因子ZEB1起作用；6、8Gyγ射线照射72h后，TGF-β表达水平升高，但干扰TBK1并不能下调TGF-β表达；同时，照射后p-Smad3水平升高，但干扰TBK1并不能影响p-Smad3水平，提示TGF-β/Smad3通路可能非TBK1作用通路；7、8Gyγ射线照射72h后，可以活化细胞内NF-κB通路，表现为：IκB-α表达下调，p-IκB-α表达上调；但干扰TBK1并不能影响IκB-α及p-IκB-α表达，提示NF-κB通路可能并非TBK1作用通路；8、8Gyγ射线照射72h后，p-GSK-3β表达上调，提示GSK-3β失活；干扰TBK1后p-GSK-3β水平下调，提示GSK-3β活性升高；同时，给予GSK-3β抑制剂SB216763，可以增强干扰TBK1的效应，表现为：上皮标志物E-cadherin表达上调，间质标志物Vimentin表达下调，转录因子ZEB1表达下调，提示TBK1可能通过GSK-3β调节IR诱导EMT。讨论与分析：放射性肺纤维化是影响肿瘤病人放疗效果和导致急性放射病伤员病程后期的主要死因之一，是国内外放射生物学界长期关注的研究热点和亟待破解的难题。目前，研究显示EMT在肺纤维化的发生发展中起重要作用，而电离辐射是EMT的重要诱导因素之一；本实验室前期研究提示TBK1是miR-200c直接靶点且具有癌基因样作用。在此基础上，我们考虑通过对TBK1及EMT的研究以期为揭示放射性肺纤维化机制提供实验依据。本课题研究中观察到TBK1在辐射诱导的肺纤维化中发挥了重要作用，干扰TBK1能够抑制IR对EMT的诱导作用。在对TBK1作用机制的初步探讨中，观察到干扰TBK1可影响EMT相关转录因子ZEB1的表达，通过RESCURE实验提示TBK1与ZEB1具有一定关联，在揭示这种关联时，观察到TGF-β/Smad3及NF-κB通路可能并未参与到TBK1对EMT的调节通路中，而另一细胞内广泛存在的蛋白激酶GSK-3β可能是TBK1调节ZEB1的中间蛋白。结论：IR能够诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞EMT的发生，TBK1在此过程中起负向调节作用；其中TBK1的调节作用可能是通过抑制GSK-3β磷酸化而活化GSK-3β及抑制转录因子ZEB1实现的。