大鲵烂脚病病原的分离鉴定及防治研究

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近年重庆境内大鲵烂脚病频发,采用化学抗菌药物及抗生素治疗时效果并不明显,还存在药物残留和环境污染的问题,有时会导致疾病反复发作,因此给大鲵养殖业造成了经济损失。本研究为鉴定大鲵烂脚病的病原,从自然患烂脚病大鲵的心肺中分离,经人工回归感染实验与胞外产物酶活性检测确认病原菌的致病性,按照细菌生理生化特性和分子生物学方法进行菌种鉴定,利用药敏实验检测病原菌对抗菌药物的耐药性。分离出的两种致病菌株,根据生理生化鉴定以及菌株16S rDNA序列的系统发育分析结果,确认病原为豚鼠气单胞菌与嗜水气单胞菌;致病菌株在人工感染时的发病症状与自然发病症状一致,存在致病性;此外,胞外产物酶活性也说明了致病菌株的致病性。药敏实验结果显示,豚鼠气单胞菌分离株对23种抗菌药物表现出耐药性,嗜水气单胞菌分离株对28种抗菌药物表现出耐药性,均具有多重耐药性。  根据嗜水气单胞菌的16S rDNA、外膜蛋白、溶血素及丝氨酸蛋白酶的基因设计4对引物,建立一种快速准确诊断大鲵致病性嗜水气单胞菌的四重PCR法,经PCR反应条件优化后进行检测。实验结果表明,该法特异性较好,仅嗜水气单胞菌呈阳性,其检测的敏感性较高,可检测100fg的DNA模版。利用该法进行的其他检测中,还发现33份人工感染样本全部呈阳性,34份疑似样本有21份呈阳性,说明四重PCR法可应用于临床检测。同时,对大鲵致病性嗜水气单胞菌的溶血素、外膜蛋白及丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列进行系统进化树构建、蛋白理化性质分析、蛋白信号区域和结构区域分析、蛋白二级结构预测、蛋白三级结构预测及蛋白免疫原性分析,为进一步研究嗜水气单胞菌保护性抗原多样性而提供理论基础。  采用琼脂打孔法测定中草药在不同pH值时对病原菌的体外抑菌效果,使用二倍稀释法测定中草药在不同pH值时的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。实验结果表明,200种中草药对大鲵源气单胞菌的抑制效果各不相同,其中135种中草药具有一定抑菌作用,乌梅、五味子、五倍子及诃子这4种中草药抑菌效果极强,抑菌圈明显,而pH值为中性或弱碱性时,乌梅、五味子等抑菌效果明显减弱;135种中草药对气单胞菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度有所差异,其中诃子、五倍子、石榴皮、大黄及槐角这5种中草药的MIC小于1mg/mL,抑菌作用最强。根据棋盘交叉法,设计16种中草药组合的120种双联复方和10种中草药组合的120种三联复方,评估复方的体外抑菌作用。双联复方与三联复方在抑菌作用上有显著提高,大部分复方出现协同作用,甚至一些复方出现显著协同作用。  本研究分离鉴定出大鲵烂脚病的病原为豚鼠气单胞菌与嗜水气单胞菌。建立了快速诊断大鲵致病性嗜水气单胞菌的四重PCR法。筛选出了对大鲵源气单胞菌具有较强抑制效果的中草药,这些中草药合理配伍可以大幅度提高中草药的抑菌作用,为中草药复方防控大鲵细菌性疾病提供理论基础。
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