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目的:探讨TGF-β1抑制的microRNAs及其靶基因蛋白通过MAPK信号通路调节人类横纹肌肉瘤(RMS)肌分化及其分子机制,为RMS分化治疗提供新的治疗靶点。方法:(1)采用Real-time PCR技术检测TGF-β1抑制的microRNAs在不同RMS细胞株和组织样本中的表达,筛选出差异最明显、最广泛的microRNA作为研究对象。(2)利用MTT、3H胸腺嘧啶核苷掺入法检测microRNA对RMS细胞株增殖的影响。(3)构建裸鼠成瘤性模型,观察microRNA对活体肿瘤生长的影响;采用免疫组织化学染色检测瘤体ki-67蛋白表达情况。(4)运用生物信息学技术及网络资源预测miR-411-5p的靶基因(5)运用Real-time PCR技术、双荧光素酶报告系统及蛋白印迹法验证靶基因。(6)构建Elk-1-Luc、c-Jun-Luc荧光报告质粒,SPRY4-siRNA或siRNA-ctrl转染PKC?表达质粒处理的RMS细胞株,检测Elk-1-Luc、c-Jun-Luc荧光信号;PKC?表达质粒和SPRY4-siRNA/siRNA-ctrl共转染RMS细胞株,检测P-p38蛋白的变化。(7)MKK6EE表达质粒和/或SPRY4-siRNA共转染RMS细胞株,蛋白质印记检测P-p38蛋白、免疫荧光染色观察细胞凋亡指标(caspase-3)和肌分化指标(MHC、Myosin)的变化;MKK6EE表达和/或miR-411-5p-M、I共转染RMS细胞株,蛋白质印记法检测P-p38蛋白、免疫荧光染色观察细胞凋指标(caspase-3)和肌分化指标(MHC、Myosin)的变化;流式细胞技术细胞周期试剂盒检测细胞周期的改变;miR-411-5p-M或SPRY4-siRNA转染RMS细胞,3H胸腺嘧啶核苷掺入法检测细胞增殖情况,蛋白质印记法检测cleavedcaspase-3表达量。(8)real-timepcr分析人rms组织中tgf-β1与spry4mrna的相关性。(9)采用免疫组织化学技术进行tgf-β1、spry4、p-p38蛋白染色,并进行临床病理相关性分析。结果:(1)在tgf-β1敲低的rms细胞株和组织中mir-411-5p差异的最明显、最广泛。(2)mir-411-5p能够抑制rms细胞株的增殖。(3)mir-411-5p能够抑制裸鼠皮下rms肿瘤体积增长及ki-67蛋白表达。(4)预测mir-411-5p的候选靶基因有六个,分别为calmodulin-like4(calml4),sprouthomolog4(spry4),generaltranscriptionfactor21(gtf21),transcriptionfactor(sp2),setnuclearoncogene(set)和glutamatereceptormetabotropic3(grm3)。(5)spry4是mir-411-5p的直接靶基因。(6)spry4sirna能够增强elk-1-luc、c-jun-luc的荧光信号;sirna-ctrl组p-erkp-jnk蛋白表达增加明显,p-p38蛋白表达增加不明显,然而spry4sirna组蛋白印迹检测p-erk、p-jnk蛋白表达增加不明显,p-p38蛋白表达增加明显。(7)mkk6ee表达质粒+spry4-sirna组p-p38蛋白表达显著增加,细胞凋亡指标(caspase-3)增加和肌分化指标(mhc、myosin)的增多。mkk6ee+mir-411-5p-m组p-p38蛋白量显著增加、促进细胞凋亡指标(caspase-3)和增加肌分化指标(mhc、myosin)表达,细胞周期在g1期细胞比例增加。mir-411-5pm或spry4-sirna转染rms细胞,3h胸腺嘧啶核苷掺入量均明显下降,蛋白质印记技术检测cleavedcaspase-3蛋白表达量增加。(8)rms组织中tgf-β1蛋白表达量与spry4mrna表达量负相关。(9)在分化差的rms组织中,tgf-β1和spry4蛋白高表达,而p-p38低表达;在分化好的rms组织中,tgf-β1和spry4蛋白低表达,而p-p38高表达。结论:1.tgf-β1负调节mir-411-5p及mir-411-5p抑制rms细胞株的增殖能力。2.spry4是mir-411-5p调控的下游直接靶基因。3.spry4抑制pkc?介导的mapk信号通路活化,尤其是抑制p38mapk的激活,从而阻滞rms分化。4.在人rms组织样本中,tgf-β1蛋白表达水平与spry4正相关,与miR-411-5p的mRNA水平、P-p38MAPK蛋白表达负相关。