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第一部分:RECK基因在胃癌中的表达及临床意义的实验研究
目的:检测基质金属蛋白酶抑制基因RECK(reversion-inducing-cysteine-richproteinwithKazalmotifs，RECK)及MMP-9在胃癌组织和正常胃组织中mRNA的表达水平并探讨其临床意义。
方法:采用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)，检测47例胃癌患者的肿瘤组织和正常胃组织中RECK基因及MMP-9mRNA的表达。
结果:47例胃癌患者的正常组织中RECKmRNA的相对表达量为0.793±0.012，肿瘤组织中的表达量为0.314±0.076，两者差异有极显著性意义(P＜0.01)；正常组织中MMP-9mRNA的相对表达量为0.225±0.107，肿瘤组织中的表达量为0.663±0.098，两者表达有显著性差异(P＜0.05)，胃癌组织中RECK基因mRNA的表达水平与MMP-9mRNA的表达水平呈正相关(r=0.55，P＜0.05)；RECK的表达水平与肿瘤浸润深度和周围脏器侵犯密切相关(P＜0.05)；RECK表达水平高于0.314的患者其2年生存率要显著高于RECK表达水平低者(P=0.043)。
结论:胃癌组织中RECK基因的转录水平显著降低，RECK基因与MMP-9存在某种共同的转录调节机制；RECK基因低表达的肿瘤具有更强的侵袭能力，其表达与胃癌患者的预后密切相关。RECK基因可能成为判断胃癌患者预后的一种新指标及肿瘤治疗的新靶点。
第二部分:人RECK基因的分子克隆及真核表达载体的构建
目的:克隆人RECK(reversion-inducing-cysteine-richproteinwithKazalmotifs)基因，并构建RECK基因的真核表达载体pcDNA3-RECK。
方法:从人的胎盘组织中提取总RNA，经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出人RECK基因；将RECK基因克隆入载体pBluescriptⅡSK+中，阳性克隆经酶切、电泳鉴定并测定RECK基因序列确认后将pBluescriptⅡSK+-RECK酶切所得RECK基因片段插入真核表达载体pcDNA3中，构建RECK基因的真核表达载体pcDNA3-RECK并经酶切鉴定。
结果:PCR扩增得到了特异性的4.4kb基因片段。基因片段的大小与预期一致。所获得的RECK基因测序及BLAST分析证明克隆的人RECK基因序列正确，pcDNA3-RECK经酶切后得到5.4kb和4.4kb两个片段。
结论:成功的克隆了人RECK基因并正确构建了其真核表达载体pcDNA3-RECK。
第三部分:RECK基因对人胃癌细胞株MKN-45生物学行为的影响的研究
目的:探讨转染外源性的RECK基因对MKN-45胃癌细胞体外及体内生物学活性的影响。
方法:采用脂质体Lipofectamine2000介导将真核表达载体pcDNA3-RECK导入体外培养的MKN-45细胞，RT-PCR及Westernblot检测转染前后MKN-45细胞中RECKmRNA和蛋白质的表达。明胶酶谱试验检测转染前后细胞中MMP-9的活性。细胞计数法绘制各组细胞的生长曲线以观察RECK基因对细胞增殖能力的影响；利用流式细胞仪方法检测转染前后细胞凋亡率；Boyden小室实验计算各组穿膜的细胞数以比较转染RECK基因对细胞侵袭能力的变化；比较裸鼠成瘤大小及肿瘤转移的比例；应用免疫组织化学方法检测裸鼠肿瘤组织中血管内皮细胞特异性第Ⅷ因子相关抗原(FⅧRAg)和各组细胞ICAM-1的表达，依据FⅧRAg的表达评价肿瘤组织内微血管密度(MVD)。
结果:转染pcDNA3-RECK真核表达载体后MKN-45细胞能稳定高表达RECKmRNA和蛋白，而转染空质粒组和未转染组未检测到RECK基因的表达；转染组中具有生物活性MMP-9的表达显著降低(P＜0.05)。转染前后MKN-45细胞的生长曲线、细胞体外迁徙能力以及细胞凋亡率无明显差异(P＞0.05)，但其体外侵袭能力明显下降(P＜0.05)；转染RECK组细胞ICAM-1的表达显著减少(P＜0.05)。转染RECK组的成瘤体积与转染空质粒组无明显差异(P＞0.05)，但转染组远处转移率显著低于未转染组(P＜0.05)，转染组肿瘤组织内MVD显著降低(P＜0.01)。
结论:成功的利用脂质体Lipofectamine2000将真核表达载体pcDNA3-RECK导入倒MKN-45细胞，经过筛选后得到了稳定高表达RECK蛋白的MKN-45细胞株，RECK基因能显著抑制MMP-9的活性及ICAM-1的表达，RECK的表达不影响MKN-45细胞的生长、细胞体外迁徙能力、细胞凋亡率及成瘤体积，但可显著抑制其体外和体内的侵袭及转移能力以及抑制肿瘤血管的生成
第四部分:转录因子Sp1对人胃癌细胞MKN-45中RECK基因表达的调控作用
目的:探讨肿瘤坏死因子a(TNF-α)对人胃癌细胞MKN-45中RECK基因及MMP-9表达的影响，检测转录因子Sp1在调节RECK基因转录调控中的作用。
方法:将培养的MKN-45细胞分为3组：A组1U/ml、5U/ml、10U/ml3种浓度的TNF-α作用人胃癌细胞MKN-45细胞株6h；B组用浓度为10U/ml的TNF-α作用MKN-45细胞1h、2h、4h、6h；C组用1mmol/ml、5mmol/ml、10mmol/ml的二硫代氨基甲酸吡硌烷(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)与TNF-α(10U/ml)同时作用于MKN-45细胞6h，RT-PCR法检测三组细胞RECK基因mRNA的表达，凝胶滞留电泳实验(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)DNA结合反应检测细胞Sp1的活性。
结果:未处理的MKN-45细胞不表达RECKmRNA，随着TNF-α浓度的增加以及作用时间的延长，RECK基因出现表达且表达量显著增加(P＜0.01)。TNF-α能激活Sp1的活性，PDTC能抑制TNF-α对Sp1的激活以及上调RECK基因转录的作用。
结论:TNF-α可通过激活Sp1上调肿瘤抑制基因RECK在胃癌细胞系MKN-45中的表达，这种调节作用呈现时间和剂量依赖关系，Sp1是RECK基因的转录激活因子之一。