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目的：D-双功能蛋白(D-bifunctional protein，DBP)是哺乳动物过氧化物酶体中参与脂肪酸β-氧化的一种酶，广泛分布于全身各组织细胞的过氧化物酶体内，尤其在肝脏组织中高度表达。DBP是机体正常新陈代谢和生长发育过程中必不可少的一种酶，在极长链脂肪酸的β-氧化、二十二碳六烯酸(DHA)的合成以及胆汁酸合成等代谢过程中都发挥着重要作用。人类DBP缺陷会出现严重的精神和动作发育滞后，甚至死亡。但到目前为止，DBP的表达调控机制尚不清楚。研究DBP的表达调控机制对了解如何维持正常脂质代谢以及相关疾病的发病机制都具有十分重要的意义。 人DBP基因位于5号染色体q2，它由24个外显子和23个内含子组成，长约100Kb。DBP mRNA全长为2593bp，翻译区位于49～259bp，编码736个氨基酸。DBP基因的上游调控区存在两个核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)结合位点，分别位于转录起始点上游-1617/-1608(site A)和-422/-413(site B)，但DBP的表达是否受NF-κB的调节?如何调节?未见报道。 NF-κB是细胞内重要的核转录因子，激活后与靶基因上游调控区的NF-κB结合位点结合，发挥对其靶基因的转录调控作用。静息状态时，NF-κB二聚体在胞浆与抑制性蛋白I-κB结合，形成无活性的复合物。当肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)等相关的信号分子与其细胞膜受体特异性结合后，I-κB被磷酸化，使其从无活性的复合物上脱落，NF-κB得以活化。活化的NF-κB进入细胞核内，结合于靶基因上游调控区的NF-κB结合位点，对靶基因的转录进行调控。白介素-6(Interleukin-6，IL-6)和白介素-8(Interleukin-8，IL-8)就是肝细胞中受NF-κB上调的典型靶基因。 根据人前列腺癌组织及细胞中NF-κB的激活伴随着DBP的表达增加的报道，以及DBP上游存有NF-κB结合位点的事实，我们推测，肝中激活的NF-κB也可能与DBP上游的NF-κB结合位点结合，促进DBP在肝脏中的表达。因此，本实验选用人肝癌细胞株HepG2作为研究对象，使用TNF-α和吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)分别激活和抑制NF-κ3的活性后，采用RT-real time PCR，western blotting，ChIP和Oligo pull down等方法，观察了NF-κB激活与DBP表达的关系，以探讨NF-κB对DBP表达的调控机制。 方法： 1细胞培养 人类肝癌细胞株HepG2采用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养液，置37℃，5％CO2及饱和湿度下培养24小时，换用无血清的RPMI1640培养液再培养24小时。然后换用含刺激因素和10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养至所需时间后，收集细胞用于以下实验。 2观察激活NF-κB对DBP的mRNA表达的影响 (1)分别给予细胞0ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，30ng/ml TNF-α刺激，作用0.5 h后收取细胞，提取核蛋白，进行Western Blotting对核内NF-κB的量进行测定。 (2)用相同浓度(10ng/ml)的TNF-α，分别于给予细胞0 h，0.5 h，1 h，2 h的刺激后，收取细胞，提取细胞总RNA，进行RT-real time PCR，测定NF-κB的靶基因IL-6和IL-8，以及DBP mRNA的相对表达量。 (3)给予细胞相同时间(0.5 h)不同浓度(0，10，20，30ng/ml)的TNF-α刺激后，收取细胞，提取细胞总RNA，进行RT-real time PCR，对IL-6和IL-8以及DBP mRNA的相对表达量进行测定。 3抑制NF-κB的激活可降低DBP mRNA的表达 (1)分别给予细胞0μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L，50μmol/LPDTC刺激2 h后，给予30ng/ml TNF-α继续刺激0.5 h，收取细胞，提取核蛋白，进行Western Blotting对核内NF-κB的量进行测定。 (2)分别给予细胞0μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L，50μmol/LPDTC刺激2 h后，给予30ng/ml TNF-α继续刺激0.5 h，收取细胞，提取细胞总RNA，进行RT-real time PCR，对IL-6和IL-8以及DBP mRNA的相对表达量进行测定。 4观察NF-κB的激活或抑制对肝细胞DBP的蛋白水平的影响 (1)给予细胞相同浓度(30ng/m1)的TNF-α，分别作用0 h，0.5 h，1 h，2 h，3 h后收取细胞，提取总蛋白，进行Western Blotting对DBP蛋白量进行测定。 (2)分别给予细胞0ng/ml，1ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，30ng/ml TNF-α刺激，作用2 h后收取细胞，提取总蛋白，进行Western Blotting对DBP蛋白量进行测定。 (3)分别给予细胞2 h不同浓度的PDTC(0，5，10，20，500μmol/L)刺激后，给予30ng/ml TNF-α继续刺激2 h，提取总蛋白，进行western blotting对DBP蛋白量进行测定。 5观察激活的NF-κB是否与DBP上游NF-κB位点结合 (1)分别给予细胞0μmol/L和50μmol/L的PDTC刺激2 h，再给予30ng/ml的TNF-α刺激0.5 h后，收取细胞，用染色质免疫共沉淀(Chromatinco-immunoprecipitation，ChIP)方法，对激活的NF-κB与DBP上游结合的位点进行定性定量分析。 (2)分别给予细胞0μmol/L和50μmol/L的PDTC刺激2 h，再给予30ng/ml的TNF-α刺激0.5 h后，收取细胞，用Oligo pull down方法，对结合在DBP上游NF-κB结合位点的NF-κB进行定性定量分析。 6数据处理 实验重复3次，所有数据均用X-±S表示，采用SPSS13.0软件进行统计学分析，对所测定结果进行两个独立样本t检验(双尾)，检验以P<0.05为差异有统计学意义。 结果： 1激活NF-κB可促进DBP的mRNA表达 (1)不同浓度的TNF-α(0，1，10，20，30ng/ml)刺激细胞0.5 h后，核内NF-κB p65蛋白量随TNF-α浓度的增加呈剂量依赖性增加，并于30ng/ml时达到高峰，为对照组的6倍。表明NF-κB被激活。 (2)用10ng/ml TNF-α刺激细胞0 h，0.5 h，1 h，2 h后： a细胞中IL-6和IL-8的mRNA表达水平明显增加，并于0.5 h时达到高峰，表明，激活NF-κB促进了靶基因mRNA的表达； b伴随IL-6和IL-8的mRNA表达增加，细胞中DBP的mRNA水平也明显增加，也于0.5 h时达到高峰，为对照组的24倍。 表明：激活NF-κB可促进DBP的mRNA表达。 (3)不同浓度的TNF-α(0，10，20，30ng/ml)刺激细胞0.5 h后： a细胞中IL-6和IL-8的mRNA表达水平随着TNF-α浓度的增加呈剂量依赖性增加，并于30ng/ml时达到高峰； b DBP的mRNA表达也随TNF-α浓度呈剂量依赖性增加，也于30ng/ml时达到高峰，为对照组的73倍。 表明：NF-κB的激活可促进DBP的mRNA表达。 2抑制NF-κ3的激活可逆转由TNF-α引起的DBP mRNA的表达增加 不同浓度PDTC(0，5，10，20，50μmol/L)刺激细胞2 h，再用相同浓度TNF-α(30ng/ml)刺激细胞0.5 h后： a随着PDTC刺激浓度的增加，NF-κB p65的蛋白的入核量呈剂量依赖性降低。50μmol/L PDTC时最低，与单独TNF-α刺激组相比，降低了90％； b随着PDTC刺激浓度的增加，IL-6和IL-8的表达呈剂量依赖性降低，50μmol/L PDTC时最低； c随着PDTC刺激浓度的增加，DBP的mRNA表达也呈剂量依赖性降低。也于50μmol/L时最低，与单独TNF-α刺激组相比，降低了55％： 表明，抑制NF-κB的激活可逆转由TNF-α引起的DBP mRNA的表达增加。 3 DBP的蛋白水平随着NF-κB的激活或抑制而改变 (1)用30ng/ml TNF-α刺激细胞0 h，0.5 h，1 h，2 h，3 h后，DBP的蛋白量随着刺激时间的延长明显增加，并于2 h时达到高峰，为对照组的5倍，之后随着刺激时间进一步延长，DBP的蛋白量下降。 (2)用不同浓度TNF-α(0，1，10，20，30ng/ml)刺激细胞2 h后，DBP的蛋白量随着TNF-α浓度的增加呈剂量依赖性增加，并于30ng/ml时达到高峰，为对照组的11倍。 (3)用不同浓度PDTC(0，5，10，20，50μmol/L)刺激细胞2 h，再和30ng/ml TNF-α共同刺激细胞2 h后，DBP的蛋白量也随着PDTC浓度的增加呈剂量依赖性降低，并于50μmol/L时为最低，与单独TNF-α刺激组相比，降低了53％。 表明，激活NF-κB可以促进DBP的转录，进而增加DBP的蛋白量；抑制NF-κB的激活可逆转激活NF-κB所产生的上述结果。 4 NF-κB通过与DBP上游NF-κB结合位点结合促进DBP mRNA的表达 (1)ChIP实验结果显示，30ng/ml TNF-α作用细胞0.5 h，可以显著增加NF-κB结合位点site A与NF-κB p65的结合，而PDTC(50μmol/L)可以使此结合显著降低；同样条件下，NF-κB激活或抑制却不能改变NF-κB结合位点Site B与NF-κB p65的结合。说明DBP上游的两个NF-κB位点能够与NF-κB结合，但主要通过site A与NF-κB结合上调DBP的转录。 (2)Oligo pull down的结果显示，用TNF-α激活NF-κB可以显著增加NF-κB p65与site A探针的结合，而PDTC也可使此结合显著降低；同样条件下，NF-κB激活或抑制却不能改变NF-κB p65与site B探针的结合量。进一步说明，NF-κB能够与site A和site B结合，但主要通过与site A结合上调DBP的转录。 综上所述，NF-κB是通过与DBP上游site A位点的结合来促进DBP的表达的。 结论： 1激活NF-κB能够促进DBP的表达。 2激活的NF-κB通过与site A结合调控DBP的转录。