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猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）属于疱疹病毒甲亚科的水痘疱疹病毒属,是一种宿主范围广泛的双链线性DNA病毒,其基因组大小约143 kb,有70多个编码蛋白的功能基因。PRV引起的猪伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是一种急性传染病,主要表现为母猪妊娠失败、公猪不育、新生仔猪呼吸困难、生长停滞、以及神经系统症状。该病在猪群中传播快,传播途径多,且流行范围广、死亡率高,给养猪业带来了巨大的损失。鸟苷酸结合蛋白1（Guanylate-binding protein 1,GBP1）属于鸟苷酸结合蛋白家族（GBPs）,是干扰素诱导的GTPases超家族（65-72 k Da）成员之一,能够抑制细菌增殖、病毒复制以及促进炎症反应形成,在抗病原微生物反应中发挥着重要作用。但是GBP1在PRV感染过程中的作用目前还未见研究报道。本研究成功分离得到一株PRV,在此基础上,以PK-15细胞作为基因编辑的模式细胞,运用靶向于猪gbp1基因的CRISPR-Cas9重组慢病毒感染野生型PK-15细胞,经过最适浓度嘌呤霉素筛选,得到阳性单克隆细胞,经过扩大培养,成功获得一株gbp1基因缺失细胞系,再以相同感染复数的PRV分别感染野生型PK-15细胞、gbp1基因缺失PK-15细胞等,通过Real-time PCR和Western blotting等方法检测PRV感染细胞后宿主蛋白GBP1的变化以及病毒拷贝数的变化,以期明确GBP1在PRV感染过程中的作用。研究取得以下实验结果:1.经过PCR检测、蚀斑纯化和细胞扩大培养,成功分离得到一株PRV分离株,命名为SNBL1株。经PCR扩增PRV（SNBL1）株g B、g C、g E基因全长并测序后,与Gen Bank中其他29株PRV分离株的g B、g C、g E的基因进行比对,系统进化树和核酸同源性分析显示,PRV（SNBL1）株同国内流行毒株同属一支,同源性较高。与国内2012年以后分离得到的毒株同源性在95.9%～100.0%之间。氨基酸同源性及其差异氨基酸残基分析显示:PRV（SNBL1）株g B的第472位氨基酸残基突变为甘氨酸（G）,第761位氨基酸残基突变为丝氨酸（S）;PRV（SNBL1）株g C的第461位氨基酸残基突变为丙氨酸（A）,第477-487位氨基酸残基均发生突变;PRV（SNBL1）株g E的氨基酸序列无突变发生。同时构建PRV g C重组原核表达载体,经过诱导纯化,得到重组蛋白后,免疫6周龄Balb/c小鼠,待ELISA检测抗血清效价达到1:10000～1:100000时,采全血,分离血清,经Western blotting验证,成功获取可以用于检测PRV g C蛋白的多克隆抗体。2.基于CRISPR-Cas9慢病毒敲除系统,成功获取了一株gbp1基因缺失细胞。Western blotting结果显示,靶向于gbp1基因第278位点构建的基因缺失细胞检测不到GBP1蛋白;基因组靶位点测序结果显示,在靶向于gbp1基因278位点构建的gbp1基因缺失细胞中,其核酸序列第270～276位共7位碱基缺失,导致之后的序列发生移码,GBP1氨基酸序列的第90～93位氨基酸残基均发生突变,并在第94位氨基酸移码终止。3.使用1 MOI PRV分别感染野生型PK-15细胞,23PK-15gbp1+/+细胞,109PK-15gbp1+/+细胞,278PK-15gbp1-/-细胞,于感染后24 h和48 h收取各组细胞,Real-time PCR检测结果显示:在PRV感染后24 h和48 h,278PK-15gbp1-/-细胞组中的PRV DNA拷贝数显著高于其他三组中的PRV DNA拷贝数;TCID50结果显示:在PRV感染后24 h和48 h,278PK-15gbp1-/-细胞组中的病毒水平也显著高于其他三组中的病毒水平;同时Western blotting检测结果显示278PK-15gbp1-/-细胞组的PRV g C蛋白水平显著高于其他三组的PRV g C蛋白水平。进一步检测GBP1过表达对PRV复制的影响,结果显示:在PRV感染后24 h和48 h,PK-15GBP1细胞组中的PRV DNA拷贝数显著低于其他两组中的PRV DNA拷贝数;TCID50结果显示:在PRV感染后24 h和48 h,PK-15GBP1细胞组的病毒水平也显著低于其他两组的病毒水平;同时Western blotting检测结果显示PK-15GBP1细胞组的PRV g C蛋白水平显著低于其他两组的PRV g C蛋白水平。综合以上结果,本研究工作成功分离到一株PRV毒株,制备了可以用于检测PRV g C蛋白的多克隆抗体,并且构建了gbp1基因缺失的PK-15细胞系。通过比较PRV感染的野生型PK-15细胞和gbp1基因缺失的PK-15细胞的PRV DNA拷贝数、TCID50以及PRV g C蛋白水平变化,明确了宿主蛋白GBP1在PRV感染PK-15细胞中所发挥的抗病毒作用,确定gbp1基因缺失会导致PRV感染后复制水平增加。研究结果为进一步研究猪抗PRV感染的形成机制以及gbp1作为候选抗病基因提供了理论依据。