论文部分内容阅读
白粉病是全世界小麦产区最重要的真菌病害之一，而培育和种植抗病品种是防治白粉病最为有效的方法。迄今已在小麦的19对染色体、61个位点上定位了85个抗病主效基因/等位基因，但仅有Pm3b、Pm8、Pm21、Pm60、Pm2a和Pm24等少数几个被图位或同源克隆。偃麦草属物种免疫或高抗小麦白粉、条锈、叶锈等多种病害，已成为小麦优良基因的重要来源。本研究以衍生于八倍体小偃麦的高抗白粉病小麦新品系CH1357和CH006为实验材料，通过对抗性分离群体的遗传分析，明确了抗病基因的显隐性及数目，并利用分子标记对抗性基因进行了图位克隆或遗传定位；同时对目标基因连锁标记的有效性进行了验证与评价，为进一步解析小麦抗病基因的结构与功能、深入了解白粉病抗性的分子机制以及小麦分子标记辅助育种奠定了基础。主要研究结果如下：
1、PmCH1357的初步定位。小偃麦衍生品系CH1357对包括E09在内的27个白粉菌株表现为免疫或高抗，是一个优异抗源。通过对源于两个杂交组合“台长29/CH1357、绵阳11/CH1357”的F1、BC1及F2:3家系接种白粉菌株E09及其抗性遗传分析，发现CH1357对白粉病的抗性受1对显性核基因控制，暂命名为PmCH1357；利用分离群体分组分析法(bulked segregant analysis, BSA)和SSR标记，初步将PmCH1357定位于小麦5D染色体的短臂(5DS)。其侧翼连锁标记为Xcfd81和Xbwm8，在上述2个作图群体中，抗性基因与侧翼连锁标记的遗传距离分别为2.0cM/11.3cM、1.5cM/8.9cM。PmCH1357与5DS染色体上已报道的其他抗白粉病基因有不同的系谱和抗谱，可能是一个新抗源。
2、连锁标记的选择效率评价。为评价PmCH1357连锁标记在分子标记辅助育种中的有效性，在苗期接种E09进行抗性鉴定的同时，利用PmCH1357的8个连锁标记(Xcfd81、Xbwm20、Xbwm21、Xbwm25、Xmp510、Xbwm8、Xbwm9和Xgwm190)对感白粉病品种晋麦66与CH1357构建的341个F2:3家系进行检测，在该群体中发现，4个标记(Xcfd81、Xbwm20、Xbwm21和Xbwm25)的纯合抗病基因型与纯合抗病表现型的符合率均达到93%以上，可用于抗病育种中PmCH1357的标记选择；还发现使用多个标记组合可影响标记辅助选择的准确性。如果使用基因的同侧标记组合会降低选择效率，而使用基因的两侧标记组合则可以提高选择的准确性。而且，使用标记组合Xcfd81+Xbwm8对PmCH1357进行选择的准确性会更高，获得的纯合抗病基因型植株会更多。
3、PmCH1357的图位克隆。根据PmCH1357的初步定位结果，从F2代、F2:3代家系筛选抗性位点杂合的植株进行自交，产生了由2252个F3:4植株组成的精细定位群体。用此群体，将PmCH1357限制在一个526kb的物理区间。该区间仅含有一个可能的候选基因TraesCS5D01G044600，编码典型的NBS-LRR抗病蛋白。研究发现，感亲TC29中感的等位基因序列与中国春相同；而抗亲CH1357中抗的等位基因序列与已克隆的Pm2a(前苏联小麦种质Ulka/8*CC)相同。而且，TC29的感病等位基因中，其外显子1含有一个7bp的碱基缺失，导致编码的蛋白质合成提前终止，造成由Pm2a编码的由1277个氨基酸组成的NLR蛋白中缺少了856个氨基酸，从而丧失其抗病功能。对4个中国其他品种(系)的5DS上已报道的抗白粉基因或等位基因Pm2b、Pm2c、PmLX66及PmND399进行克隆及测序，发现它们含有相同的PmCH1357/Pm2a抗病等位基因。根据感病等位基因的7-bp缺失开发了PmCH1357的功能标记，并检测了495份来自中国、美国的品种(系)和农家种以及中国的微核心种质，发现仅有10份含有PmCH1357/Pm2a的抗病等位基因，因此，新开发的7-bpInDel诊断性功能标记可用于该基因的分子标记辅助育种。
4、PmCH006的分子定位。对来自“台长29/CH006”组合的F1、BC1以及BC4F2:3家系接种E09，并进行抗性遗传分析，发现CH006的白粉病抗性受1对显性核基因控制，暂命名为PmCH006。利用iSelect90KSNP芯片扫描抗病、感病池，发现与抗病表型相关联的SNP有22个，且其中的9个位于染色体臂2AL，故将PmCH006初步定位在2AL上。据此，利用中国春小麦2AL上相应的762-768Mb序列区段开发了13个新的多态性标记，并用于检测由415个植株组成的BC4F2次级群体。结果将PmCH006定位在2AL上共显性标记Xsnp10的近端，其遗传距离为0.7cM，对应于中国春2AL上762.318Mb的附近。随后，在中国春2AL的761Mb-762Mb序列区段又开发了4个与PmCH006连锁的多态性标记，并检测次级群体，最终将PmCH006限制在一个1.2cM的遗传区间，相当于1Mb的物理区间。PmCH006的两侧标记为SSR01/SSR04(远端)和2AL17(近端)，其遗传距离分别为0.3cM和0.9cM。已有几个抗白粉基因或等位基因定位在2AL，但PmCH006与这些基因的遗传关系及其来源需要进一步研究。
1、PmCH1357的初步定位。小偃麦衍生品系CH1357对包括E09在内的27个白粉菌株表现为免疫或高抗，是一个优异抗源。通过对源于两个杂交组合“台长29/CH1357、绵阳11/CH1357”的F1、BC1及F2:3家系接种白粉菌株E09及其抗性遗传分析，发现CH1357对白粉病的抗性受1对显性核基因控制，暂命名为PmCH1357；利用分离群体分组分析法(bulked segregant analysis, BSA)和SSR标记，初步将PmCH1357定位于小麦5D染色体的短臂(5DS)。其侧翼连锁标记为Xcfd81和Xbwm8，在上述2个作图群体中，抗性基因与侧翼连锁标记的遗传距离分别为2.0cM/11.3cM、1.5cM/8.9cM。PmCH1357与5DS染色体上已报道的其他抗白粉病基因有不同的系谱和抗谱，可能是一个新抗源。
2、连锁标记的选择效率评价。为评价PmCH1357连锁标记在分子标记辅助育种中的有效性，在苗期接种E09进行抗性鉴定的同时，利用PmCH1357的8个连锁标记(Xcfd81、Xbwm20、Xbwm21、Xbwm25、Xmp510、Xbwm8、Xbwm9和Xgwm190)对感白粉病品种晋麦66与CH1357构建的341个F2:3家系进行检测，在该群体中发现，4个标记(Xcfd81、Xbwm20、Xbwm21和Xbwm25)的纯合抗病基因型与纯合抗病表现型的符合率均达到93%以上，可用于抗病育种中PmCH1357的标记选择；还发现使用多个标记组合可影响标记辅助选择的准确性。如果使用基因的同侧标记组合会降低选择效率，而使用基因的两侧标记组合则可以提高选择的准确性。而且，使用标记组合Xcfd81+Xbwm8对PmCH1357进行选择的准确性会更高，获得的纯合抗病基因型植株会更多。
3、PmCH1357的图位克隆。根据PmCH1357的初步定位结果，从F2代、F2:3代家系筛选抗性位点杂合的植株进行自交，产生了由2252个F3:4植株组成的精细定位群体。用此群体，将PmCH1357限制在一个526kb的物理区间。该区间仅含有一个可能的候选基因TraesCS5D01G044600，编码典型的NBS-LRR抗病蛋白。研究发现，感亲TC29中感的等位基因序列与中国春相同；而抗亲CH1357中抗的等位基因序列与已克隆的Pm2a(前苏联小麦种质Ulka/8*CC)相同。而且，TC29的感病等位基因中，其外显子1含有一个7bp的碱基缺失，导致编码的蛋白质合成提前终止，造成由Pm2a编码的由1277个氨基酸组成的NLR蛋白中缺少了856个氨基酸，从而丧失其抗病功能。对4个中国其他品种(系)的5DS上已报道的抗白粉基因或等位基因Pm2b、Pm2c、PmLX66及PmND399进行克隆及测序，发现它们含有相同的PmCH1357/Pm2a抗病等位基因。根据感病等位基因的7-bp缺失开发了PmCH1357的功能标记，并检测了495份来自中国、美国的品种(系)和农家种以及中国的微核心种质，发现仅有10份含有PmCH1357/Pm2a的抗病等位基因，因此，新开发的7-bpInDel诊断性功能标记可用于该基因的分子标记辅助育种。
4、PmCH006的分子定位。对来自“台长29/CH006”组合的F1、BC1以及BC4F2:3家系接种E09，并进行抗性遗传分析，发现CH006的白粉病抗性受1对显性核基因控制，暂命名为PmCH006。利用iSelect90KSNP芯片扫描抗病、感病池，发现与抗病表型相关联的SNP有22个，且其中的9个位于染色体臂2AL，故将PmCH006初步定位在2AL上。据此，利用中国春小麦2AL上相应的762-768Mb序列区段开发了13个新的多态性标记，并用于检测由415个植株组成的BC4F2次级群体。结果将PmCH006定位在2AL上共显性标记Xsnp10的近端，其遗传距离为0.7cM，对应于中国春2AL上762.318Mb的附近。随后，在中国春2AL的761Mb-762Mb序列区段又开发了4个与PmCH006连锁的多态性标记，并检测次级群体，最终将PmCH006限制在一个1.2cM的遗传区间，相当于1Mb的物理区间。PmCH006的两侧标记为SSR01/SSR04(远端)和2AL17(近端)，其遗传距离分别为0.3cM和0.9cM。已有几个抗白粉基因或等位基因定位在2AL，但PmCH006与这些基因的遗传关系及其来源需要进一步研究。