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喉癌是来源于喉粘膜上皮组织的恶性肿瘤，是头颈部常见的恶性肿瘤之一。该肿瘤约占全身肿瘤的2％，在耳鼻喉科领域中仅次于鼻咽癌。近年来，随着社会发展导致的环境污染加剧，喉癌的发病率有日益增多，并且发病年龄呈现出年轻化的趋势。喉癌的治疗采用以手术治疗为主的综合治疗，包括手术治疗、放射治疗、化学药物治疗和免疫治疗等。然而近30年来喉癌患者的生存率未有明显改善。所以，急需要在分子生物学的基础上找到如何抑制喉癌发生、发展的方法。 食管癌相关基因4(esophageal cancer related gene4，ECRG4)是首先通过mRNA差异显示技术从高癌家族中和正常食管组织中分离出的一个差异表达序列，是一个具有抑癌潜能的新基因。它在几乎所有的组织中表达，包括心、脑、胎盘、肝、肺、胰腺、骨骼等。研究证实EGR4参与中枢神经系统发育与损失的反应、关节软骨细胞分化和软骨的破坏和少突胶质前体细胞老化等多种生理与病理过程。近年来的研究发现，该基因在多种肿瘤中下调表达，例如食管鳞癌、结直肠癌以及乳腺癌，所以推测该基因的表达缺失可能是参与肿瘤发展的重要因素之一。 目前对于ECRG4的研究仅局限于几种恶性肿瘤，并且其调控机制也同样需要进一步研究。启动子高甲基化是ECRG4在肿瘤中低表达和转录失活的主要机制。Gotze等研究发现，在结肠癌与胶质瘤组织中，ECRG4启动子区的甲基化高频出现，表明ECRG4在癌症组织中的下调表达与其甲基化程度密切相关。同时，用去甲基化药物处理后，ECRG4在肿瘤中的表达可以得到恢复。有研究表明，将ECRG4基因转染到食管癌细胞中能显著抑制该细胞的增殖与克隆形成能力，ECRG4的过表达使细胞周期停留在G1期。将ECRG4基因在头颈部肿瘤细胞M2中过表达，发现其过表达可以显著地降低该细胞的增殖能力和侵袭能力。Matsuzaki等也在食管癌上皮细胞中过表达ECRG4，发现该基因与Ki-67基因呈负相关性，证明了ECRG4基因能够抑制细胞的增殖。 鉴于上述ECRG4的功能仅在几种肿瘤中被证实，并且其抑制肿瘤的机制十分不明确，目前国内外尚无关于该基因在喉癌中研究的报道。所以本论文首先在喉癌临床组织样本中检测ECRG4的表达水平，明确ECRG4在喉癌中的表达和临床意。然后建立ECRG4稳定转染的喉癌细胞株并对其进行鉴定。最后，用多种方法对稳定转染ECRG4基因及对照组喉癌细胞进行增殖和凋亡的检测，同时检测各组细胞中凋亡相关蛋白的表达水平。最终明确ECRG4对喉癌细胞增殖和凋亡的影响及其相关机制。 研究方法: 本实验分为三部分，首先通过Real-time PCR和Western blot检测30个喉癌组织样本和30个癌旁组织中ECRG4的表达水平，明确ECRG4在喉癌中的表达情况。然后，检测喉癌上皮细胞系Hep-2和LSC-1中ECRG4的表达情况，并在ECRG4本底水平表达较低的Hep-2细胞中稳定转染ECRG4基因，并通过Real-time PCR、Western blot及免疫荧光检测ECRG4的表达和定位情况。最后通过MTT方法和克隆形成实验检测过表达ECRG4组细胞及对照组细胞的增殖情况，用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期，AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术和Hoechst染色检测各组细胞的凋亡情况。同时，应用Western blot技术检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bcl-2及Bax蛋白的表达，以深入研究ECRG4调控凋亡的机制。 研究结果: 一、ECRG4在喉癌中的表达和临床意义 收集我院2012年1月～2013年7月喉癌手术后病理科保存的喉癌石蜡标本及癌旁组织标本各30例。通过Real-time PCR和Western blot检测这60个样本中ECRG4的表达情况。结果显示:喉癌组织样本和癌旁样本中均有ECRG4的表达。其中喉癌组织中ECRG4的表达水平较癌旁组织显著下降（P＜0.01）。 二、过表达ECRG4喉癌细胞系的选择 体外培养两种人喉癌上皮细胞Hep-2及LSC-1，Western blot检测两株细胞中ECRG4的表达水平。结果显示:LSC-1细胞中ECRG4的表达水平显著高于Hep-2细胞(P＜0.01)。选择ECRG4本底水平较低的Hep-2细胞系作为转染所用的细胞。 三、过表达ECRG4喉癌细胞系的建立及鉴定 首先，构建ECRG4过表达载体pcDNA3.1-ECRG4，测序正确后，分别将pcDNA3.1-ECRG4和空载体质粒pcDNA3.1稳定转染到Hep-2细胞中。实验分为未转染组（Hep-2）、空载体转染组(Vector)及pcDNA3.1-ECRG4转染组(ECRG4)。然后用Western blot和Real-time PCR技术检测各组细胞中EGRC4的表达情况。同时，用免疫荧光技术检测各组细胞中ECRG4的表达及细胞中的定位。结果显示:Western blot和Real-time PCR均显示，与Hep-2组相比，ECRG4组中ECRG4的水平显著提高（P＜0.01），而Vector中ECRG4的水平并无显著差异（P＞0.05）。免疫荧光结果显示ECRG4在胞浆和核中均有表达，但主要定位于胞浆中，并且各组中ECRG4的表达水平与Western blot和Real-time PCR的结果一致。 四、过表达ECRG4对喉癌细胞增殖能力的影响 实验分为未转染组(Hep-2)、空载体转染组(Vector)及pcDNA3.1-ECRG4转染组(ECRG4)。通过MTT方法和克隆形成实验检测过表达ECRG4组细胞及对照组细胞的增殖情况，用流式细胞术检测各组细胞的细胞周期情况。结果显示:与Hep-2组相比，ECRG4组细胞ld、2d、3d、4d的增殖能力及克隆形成率显著下降(P＜0.01)，而Vector组细胞的这两项指标均与Hep-2组无显著差异（P＞0.05）。流式细胞检测周期的结果显示ECRG4细胞G1期的百分率(70.03％±0.28％)较Hep-2组(44.78％±0.36％)显著提高，而Vector组(43.41％±0.67％)则无显著差异（P＞0.05）。 五、过表达ECRG4对喉癌细胞凋亡的影响 实验分为未转染组(Hep-2)、空载体转染组(Vector)及pcDNA3.1-ECRG4转染组(ECRG4)。应用AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术和Hoechst染色检测各组细胞的凋亡情况。同时，应用Western blot技术检测各组细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bcl-2及Bax蛋白的表达情况，以深入研究ECRG4调控凋亡的机制。结果显示:AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术结果显示，ECRG4组细胞的凋亡(17.81％±0.062％)显著高于Hep-2组(0.04％±0.03％)（P＜0.01），而Vector组(0.26％±0.27％)与Hep-2组则无显著差异（P＞0.05）。Hoechst染色结果显示，ECRG4组细胞表示凋亡的浓染现象较Hep-2组显著增加并有部分碎片，而Vector组与Hep-2组细胞Hoechst染色荧光强度较低，细胞形态完整。Western blot结果显示与Hep-2组相比，促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP的表达量显著提高（P＜0.01），抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著降低(P＜0.01)。而Vector组中这些蛋白的表达与Hep-2组相比并无显著差异。 结论: 1、喉癌组织中ECRG4的表达水平较癌旁组织显著下降。 2、Hep-2较LSC-1细胞更适于进行ECRG4过表达。 3、成功建立ECRG4稳定过表达喉癌细胞系。 4、ECRG4在胞浆和核中均有表达，但主要定位于胞浆中。 5、过表达ECRG4能促使喉癌细胞停留在G1期。 6、过表达ECRG4能降低喉癌细胞的增殖能力。 7、过表达ECRG4能通过促进凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来促进喉癌细胞的凋亡。