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研究背景由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的结核病(Tuberculosis,TB)是世界最严重的传染病之一。同时,多耐药结核(MDR-TB)日益泛滥,治愈率仅为55%。目前治疗TB最常用的药物为利福平和异烟肼。但一线药物主要靶向Mtb发挥杀菌效应,容易出现耐药性。近年来,干扰素(Interferons,IFNs)在临床上与一线抗菌药物联合应用于TB尤其MDR-TB治疗。干扰素在感染性疾病中调控机体免疫反应存在多样性,IFNs激活JAK-STAT信号通路,促进几百种干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)产生,不同ISGs对感染性疾病影响不同。某些重要ISGs如ISG15、IFITMs、IRF1和MxA等被报道能调控Mtb感染,其余大部分ISGs对Mtb感染的效应与机制研究欠缺。Viperin作为ISGs之一,具有广谱抗病毒效应,并在巨噬细胞和树突状细胞的天然免疫防御及机体稳态维持中起重要作用。然而,Viperin是否参与巨噬细胞功能调控及抗结核感染免疫反应暂无研究。故深入研究Viperin与Mtb感染之间的相互作用,对调控Mtb感染、开发抗Mtb药物具有重要意义。研究内容1.检测TB患者PBMC/hMDMs中Viperin的表达;2.验证Viperin对巨噬细胞杀菌的影响;3.探究巨噬细胞中Viperin促Mtb感染的途径(炎症细胞因子、ROS、RNS、M1/M2极化);4.探究Viperin是否与IRAK1/TAK1结合,阻断IRAK1-TRAF6-TAK1相互作用,抑制IRAK1/TRAF6泛素化和NF-κB/MAPKs信号通路传导;5.研究Rsad2-/-C57BL/6J小鼠抗Mtb感染能力。研究方法1.通过RT-PCR和WB检测TB患者与健康者PBMCs/hMDMs和H37Rv感染hMDMs、THP-1Mφ 和 BMDM 中 Viperin 的表达;2.H37Rv CFU检测Viperin对巨噬细胞杀菌的影响;3.RT-PCR、ELISA和luminex检测H37Rv感染hMDMs/BMDM中参与杀菌的炎症因子TNF-α,IL-6,IL-10,TGF-β 和 IFN-α/β/γ 的表达;4.H37Rv 感染 Rsad2-/-BMDM:RT-PCR 和 WB 检测 iNOS;Griess-Reagent-System 检测巨噬细胞分泌 Nitric Oxide(NO)水平;WB 检测 TAK1-IKKα/β-NF-κB/MAPKs通路激酶磷酸化水平;ROS-Activity-Assay-Kit检测活性氧水平;用NO抑制剂(L-NAME HCl)、NF-κB抑制剂(JSH-23)、JNK抑制剂(SP600125)预处理Mφ,H37Rv CFU检测各抑制剂对Viperin促菌效应的回复;5.H37Rv 感染 BMDM:CO-IP 检测与 Viperin 结合的 IRAK1、TRAF6、TAK1 和 Myd88;293T过表达相应质粒,CO-IP检测与IRAK1、TRAF6和TAK1结合的Viperin结构域;6.IHC检测TB患者的肺和淋巴结中Viperin的表达;7.Rsad2-/-小鼠活体感染Mtb 1周和4周,小鼠脾肺CFU验证Rsad2-/-小鼠的抗Mtb感染能力;研究结果1.在TB患者肺和淋巴结中Viperin高表达,Mtb促进患者PBMCs/hMDMs中Viperin高表达;Viperin促进巨噬细胞Mtb感染;2.Viperin抑制Mtb感染巨噬细胞中炎症细胞因子产生;3.Viperin在Mtb感染过程中通过NF-κB和MAPKs信号通路负调NO产生;4.Viperin与IRAK1和TAK1结合,阻碍IRAK1-TRAF6-TAK1复合物相互作用,抑制IRAK1和TRAF6泛素化,从而抑制TAK1-IKKα/β信号传导;5.Rsad2-/-小鼠活体对Mtb感染更具抵抗力;结论Viperin在肺结核患者PBMCs/单核细胞中和Mtb感染体外巨噬细胞中均能显著被诱导。此外,本课题发现Viperin抑制炎症细胞因子和NO的产生,促进Mtb感染巨噬细胞,提示Viperin参与Mtb感染后天然免疫激活。Rsad2-/-敲除鼠体外实验证明Viperin与IRAK1和TAK1结合,阻碍IRAK1-TRAF6-TAK1复合物的相互作用,抑制IRAK1和TRAF6泛素化。从而抑制TAK1-IKKα/β-NF-κB/MAPKs信号通路激活,减少炎症细胞因子和NO产生,促进Mtb感染巨噬细胞。鉴于Viperin在先天免疫应答调节中的重要作用,Viperin可能是结核病辅助性HDT的潜在靶标。