论文部分内容阅读
肝素是由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸等交替组成的一种酸性粘多糖,具有较高含量的硫酸基,是已知负电荷密度最高的生物大分子,具有良好的抗凝血作用,是临床使用最广泛的抗凝血剂,近年来有研究还发现肝素具有降血脂、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抑制细菌黏附等作用,是重要的粘多糖类生化药物之一。目前,肝素主要以猪小肠黏膜、牛肺等组织为原料,经过提取分离得到,然而以家畜内脏为原料提取肝素存在污染高和安全质量风险等问题。此外,该来源肝素因抗凝作用过强,用药过程中容易出现出血效应等副作用,这限制了肝素非抗凝血活性的开发利用。从海洋生物中寻找提取肝素新的替代原材料越来越受到关注。前人研究已发现,一些海洋生物源肝素具有与传统肝素类似的药理活性,但抗凝血作用相对缓和,能够有效降低其用药出现的出血副作用。我们的前期研究发现一些海洋贝类富含酸性粘多糖。本研究从南海常见8种贝类中提取肝素,并比较其抗凝血活性,筛选出肝素效价较高的原料,对其结构进行解析,并评价其出血效应和抗血栓活性,以期为海洋生物源肝素的开发利用以及抗血栓活性多糖的研究提供参考。本课题主要研究内容及结果如下:(1)8种贝类肝素粗品的提取及抗凝血活性比较以南海常见8种贝类(海蚌、泥蚶、蛏子、文蛤、钝缀锦蛤、海湾扇贝、象拔蚌、菲律宾蛤蜊)为原料,采用双酶酶解、乙醇醇沉以及Sevag脱蛋白等方法制备肝素粗品,并对其理化性质和抗凝血活性进行比较分析。最终筛选出海蚌肝素和文蛤肝素为最优实验对象,其中肝素含量分别为239.2μg/mg和214.8μg/mg,硫酸基含量分别为6.2%和7.7%。两种贝类肝素主要含有Glc N、Glc A、Ido A和Glc等单糖,并且符合肝素的紫外和红外吸收特征,其抗凝血作用约为传统肝素的1/2。(2)海蚌、文蛤肝素的分离纯化及理化性质利用离子交换法和乙醇醇沉法对海蚌肝素和文蛤肝素进行分离纯化,并且对其理化性质进行分析,通过紫外光谱扫描分析其纯度,以及通过醋酸纤维电泳实验对其进行糖胺聚糖种类鉴定。结果表明,海蚌肝素和文蛤肝素经不同浓度Na Cl梯度洗脱分别获得三个组分(G1、G2、G2和M1、M2、M3)。其中,G2和M2为最优组分,其电泳迁移率与肝素最接近,提取率分别为1.17 mg/g和0.53 mg/g,肝素含量分别为88.1%和61.4%,效价分别为149.6 U/mg和122 U/mg,达到了商品化肝素的程度。(3)海蚌、文蛤肝素的结构表征采用高效液相凝胶色谱法测定G2和M2的分子量和纯度,采用刚果红实验分析其三股螺旋结构,利用同步热分析仪分析其结构热稳定性,采用红外光谱、单糖组成、二糖组成和核磁共振分析其糖链结构。结果表明,G2和M2分子量分别为30.99 k Da和22.58k Da,并且G2和M2均不具有三股螺旋结构,且结构热稳定良好。此外,G2和M2的糖链结构与肝素相似。G2主要的二糖重复单元为:→4)-α-Ido A2S-(1→4)-α-Glc NS3S6S-(1→(12.03%)、→4)-α-Ido A2S-(1→4)-α-Glc NS6S-(1→(25.81%)、→4)-β-Glc A-(1→4)-α-Glc NS6S-(1→(33.32%)、→4)-α-Ido A2S-(1→4)-α-Glc NS-(1→(26.53%)、→4)-β-Glc A-(1→4)-α-Glc NS-(1→(9.88%)和少量的→4)-β-Glc A-(1→4)-α-Glc NAc(1→(1.63%)。G2的四糖结构单元为:→4)-α-Ido A2S-(1→4)-α-Glc NS3S6S-(1→4)-β-Glc A-(1→4)-α-Glc NS6S(或Glc NAC)-(1→.和→4)-α-Ido A2S-(1→4)-α-Glc NS6S-(1→4)-β-Glc A-(1→4)-α-Glc NS6S(或Glc NAC)-(1→。M2的二糖重复片段为:→4)-α-Ido A2S-(1→4)-α-Glc NS6S-(1→(31.19%)、→4)-β-Glc A-(1→4)-α-Glc NAc(1→(23.21%)、→4)-β-Glc A-(1→4)-α-Glc NS(1→(13.87%),→4)-α-Ido A2S-(1→4)-α-Glc NS(1→(8.95%),→4)-β-Glc A-(1→4)-α-Glc NAc6S(1→(7.39%)和→4)-β-Glc A-(1→4)-α-Glc NS6S(1→(7.63%)。(4)海蚌、文蛤肝素抗血栓活性通过分析海蚌肝素和文蛤肝素的抗凝血活性和纤溶活性评价抗血栓活性。其中,通过测定凝血三项指标(APTT、PT、TT)分析其抗凝血活性,通过琼脂糖纤维蛋白平板法分析其体外纤溶活性,通过测定t-PA、u-PA和PAI-1分析其体内纤溶活性,通过小鼠断尾实验评价其出血效应。结果表明,G2和M2均具有良好的抗凝血活性,其中G2主要通过外源凝血途径、内源凝血途径和阻止纤维蛋白的形成而发挥抗凝血作用;M2主要通过外源凝血途径和内源凝血途径发挥抗凝血作用。此外,琼脂糖纤维蛋白平板法测得G2和M2的纤溶活性分别为1.96±0.11 U/mg和1.41±0.10 U/mg。G2能通过促进t-PA和u-PA的释放,同时抑制PAI-1的释放,从而发挥体内纤溶活性;M2通过促进t-PA和u-PA的释放而发挥纤溶活性。M2的纤溶能力与传统肝素相近,而在6～12mg/kg剂量范围内,G15的体内纤溶活性是传统肝素的2.2～3.8倍。此外,小鼠断尾实验表明G2和M2的出血副作用低于传统肝素,强度降低为传统肝素的1/3～1/2。